徐君毅 以敏 黃世鋒△

（1廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院普外一病區(qū) 廣西柳州 545005；2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院病理科 廣西南寧 530021）

1986年Rovesdi［1］等在研究腺病毒感染細胞的核抽提物與腺病毒的E2啟動子相互作用時發(fā)現了E2F家族的存在。E2F－1屬細胞周期相關轉錄因子E2F家族成員之一，參與構成細胞核和轉錄因子復合物，與調控細胞周期和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯系。為研究E2F－1在結直腸癌中的表達及臨床意義，本研究采用免疫組化和蛋白印跡技術對35例原發(fā)性結直腸癌標本的E2F－1表達情況進行檢測，探討E2F－1蛋白表達與臨床病理指標的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院普外一病區(qū)2008年6月至2009年2月間經病理確診的35例原發(fā)性結直腸癌手術切除標本。術中標本離體后，分別收取癌灶組織和距離癌灶邊緣5cm以上無癌浸潤的全層腸壁組織各兩塊，分別作為腫瘤組和癌旁對照組。所有癌旁對照組標本HE染色鏡下無癌浸潤。液氮中速凍10min后置于－70℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 鼠抗人E2F－1單克隆抗體由美國Santa Cruz公司提供，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠抗體、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均由北京中杉生物技術公司提供。

1.3 免疫組化 標本經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚度4μm。腫瘤組和癌旁對照組均經HE染色后閱片證實。標本常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸緩沖液pH6.1高溫高壓抗原修復2min后，10%過氧化氫和小牛血清分別作用30min。滴加稀釋的一抗（稀釋濃度為1∶200），濕盒內4℃孵育過夜，二抗和SP復合物孵育30min，每步驟間10%PBS洗片各3次，每次5 min。DAB顯色。蘇木素對比染色，梯度乙醇脫水，透明封片。PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。

1.4 蛋白印跡 提取所有組織標本核蛋白。按照BCA法進行總蛋白定量，取50μg蛋白質樣品加入含二巰基丙醇的上樣緩沖液，煮沸變性5min后上樣，以十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）進行電泳分離，電泳完畢后電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，1∶200鼠抗人單克隆抗體室溫孵育2h，TBST搖床洗膜3次，每次10min。加入1∶1000HRP標記的山羊抗鼠抗體室溫孵育1h，DAB試劑顯色，內參照蛋白為β－actin。

1.5 結果分析 （1）免疫組化：E2F－1表達定位于細胞核，陽性表現為棕黃色顆粒。隨機選取5個高倍視野，計數1000個細胞，根據陽性細胞所占比例分為4級：陽性細胞數0%～5%為陰性（－），陽性細胞數5%～25%為弱陽性（＋），陽性細胞數25%～75%為陽性（＋＋），陽性細胞數＞75%為強陽性（＋＋＋）；陽性表達率以（＋＋）和（＋＋＋）之和占總例數的百分比表示。（2）蛋白印跡：結果經凝膠圖像處理系統(tǒng)分析處理，測出目的蛋白和內參照β－actin各條帶光密度值，以目的蛋白與β－actin比值代表目的蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計分析，計量資料行采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；蛋白印跡結果行配對t檢驗，比較結直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中E2F－1蛋白表達的差異，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腫瘤組與癌旁對照組 E2F－1的陽性表達情況 腫瘤組與癌旁對照組E2F－1的陽性表達率分別為60.0.%（21／35）、5.7%（2／35）。腫瘤組 E2F－1陽性表達率明顯較癌旁對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.2 E2F－1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系見表1。如表1顯示，E2F－1的表達情況與患者年齡、性別、分化程度及部位等因素無明顯相關性，與淋巴結轉移及TNM分期均顯著相關（P＜0.05）。

表1 E2F－1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 蛋白印跡結果 用凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件進行圖像掃描和分析，分別測得E2F－1和內參照β－actin各條帶光密度值，以目的蛋白與β－actin比值代表其表達水平。腫瘤組與癌旁對照組平均表達水平分別為1.043±0.212和0.590±0.177。采用配對t檢驗比較腫瘤組和癌旁對照組中E2F－1蛋白表達量的差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 E2F－1在腫瘤組織的癌旁正常組織中的表達情況N1、N2為腫瘤組，T1、T2為癌旁對照組

3 討 論

E2F－1是E2F轉錄因子家族成員之一，參與對細胞周期進展、細胞增殖和細胞凋亡的調控。近年多項研究證實，E2F－1在多種腫瘤組織或腫瘤細胞系中表達水平異常。楊志鴻等［2］研究發(fā)現E2F－1在肺癌組織中的陽性率顯著高于正常肺組織。劉向真等［3］研究證實乳腺癌組織中E2F－1的表達率達60.71%，明顯高于正常乳腺組織，提示E2F－1與乳腺癌存在相關。伍宏彪等［4］的研究結果也提示E2F－1在早期胃癌中高表達，晚期胃癌的進展可能與E2F－1表達降低有關。我們通過試驗發(fā)現，結直腸腫瘤組織中E2F－1的陽性表達率為60.0.%（21／35），明顯高于癌旁對照組，而且E2F－1的表達異常不僅僅是陽性細胞數目的變化，其蛋白表達量亦顯著增加。與結直腸癌臨床病理特征的單因素分析結果表明，E2F－1與淋巴結轉移及TNM分期具有相關性。這一結果與楊建華等［5］的實驗結果基本相近，提示E2F－1的表達水平上調與結直腸癌的進展和預后相關。

尹永碩等［6］利用RNA干擾技術下調胃癌細胞中E2F－1的表達水平，導致胃癌細胞的增殖和侵襲能力明顯降低。E2F－1的功能是通過直接或間接對眾多下游靶基因的調控而實現的，因此，我們可以認為E2F－1表達水平的變化最終將表現為其靶基因的表達水平變化，而腫瘤細胞生物學特性的變化則是這些靶基因表達變化的綜合體現。深入研究E2F－1與靶基因的聯系，將有利于理解其生物學功能。

［1］ Kovesdi I，Reichel R，Nevins JR.Identification of a cellular transcription factor involved in E1Atrans－activation［J］.Cell.1986，25；45（2）：219－228.

［2］ 楊志鴻，阮永華，金克煒等.E2F－1基因在肺癌中的表達及意義［J］.現代生物醫(yī)學進展，2011，11（24）：4828－4830.

［3］ 劉向真，王如美.乳腺癌組織中E2F－1和Skp2的表達及意義［J］.現代腫瘤醫(yī)學，2012，20（11）：2286－2288.

［4］ 伍宏彪，張鵬，李小強，等.胃癌組織中c－met、e2f－1和Ki－67的表達［J］.上海交通大學學報（醫(yī)學版），2009，29（12）：1482－1486.

［5］ 楊建華，孫冬霞，王蕾等.大腸癌中核轉錄因子E2F－1及細胞周期因子D1的表達及意義［J］.現代預防醫(yī)學，2012，39（19）：5068－5070.

［6］ 尹永碩，肖強，謝玉波，等.轉錄因子E2F－1siRNA對胃癌MGC803細胞體外侵襲及增殖能力的影響［J］.癌癥，2008，（9）.2120－2124.