吳德明，楊志強(qiáng)，劉 翔，江 川，戴 閩

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

骨肉瘤是是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，致殘率及病死率均高。盡管近年來骨肉瘤的診斷、治療水平有了很大的提高，但骨肉瘤保肢治療效果遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度。Notch信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸的主要信號(hào)通路之一，調(diào)控多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞增殖、分化和凋亡［1～3］。人類許多腫瘤中均可檢測(cè)到Notch信號(hào)通路活性的改變，由于腫瘤來源及其微環(huán)境的不同，Notch信號(hào)通路具有促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的雙重作用［4，5］。近年來，特異性阻斷 Notch信號(hào)通路從而起到抗腫瘤作用，已作為腫瘤治療的新途徑受到了廣泛關(guān)注［6，7］。Notch1 基因是 Notch 信號(hào)通路中的重要組成部分，沉默其表達(dá)將明顯抑制Notch信號(hào)通路的功能［8，9］。2011年3月 ～2012年 5月，本實(shí)驗(yàn)通過觀察沉默Notch1基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG63增殖和凋亡的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為今后通過抑制Notch信號(hào)通路治療骨肉瘤提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人骨肉瘤細(xì)胞系MG63由武漢大學(xué)中國(guó)典型生物保藏中心提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 mNotch-1短發(fā)夾狀 RNA(mNotch-1 shRNA)片段的設(shè)計(jì)及合成:根據(jù)人Notch1基因的cDNA 序列(Genbank:NM_017617.3)，利用 Ambion公司在線設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出人Notch1基因RNA干擾(RNAi)片段(大連寶生物有限公司)。AnnexinVFITC試劑購(gòu)自晶美生物工程有限公司，小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。兔抗人Notch1抗體購(gòu)自美國(guó)ABcom公司，兔抗人Bcl-2和Bax抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz公司，PVDF膜為Millipore公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT比色法) 將MG63細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后利用mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞，利用MTT技術(shù)分析mNotch-1 shRNA轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)MG63細(xì)胞的增殖情況。加入新配制的MTT，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)，10 min后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度(A)值。根據(jù)公式:細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，經(jīng) mNotch-1 shRNA 處理細(xì)胞 24、48、72 h，分別制成單細(xì)胞懸液，加AnnexinV-FITC室溫避光10 min，沖洗、離心、重懸細(xì)胞，加入 20 μg/mL PI，4℃避光30 min后上機(jī)檢測(cè)。對(duì)照組為mNotch-1 shRNA處理后即刻上機(jī)檢測(cè)(0 h)。每組設(shè)3個(gè)樣本。分析軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 Western blot檢測(cè)相關(guān)目的蛋白表達(dá) 取經(jīng)mNotch-1 shRNA 處理24、48、72 h后的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106/mL，用胰蛋白酶消化液消化后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，加入0.5 mL預(yù)冷蛋白裂解液，劇烈振蕩使細(xì)胞重懸。按比例加入1 mL蛋白抽提試劑，振蕩均勻，4℃靜置10 min。隨后12 000 r/min、4℃離心10 min，取中間相，最后用無水乙醇洗滌并沉淀蛋白。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。取 100 μg總蛋白上樣于 10%SDSPAGE，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加兔抗人 Notch1抗體(1∶500)、兔抗人 Bcl-2抗體(1∶800)和兔抗人Bax抗體(1∶800)4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(濃度1∶4 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑發(fā)光，定影、顯影，膠片曝光。用同樣方法以β-actin作上樣對(duì)照。利用Quantity One軟件分析測(cè)定條帶相對(duì)A值，并計(jì)算 ABcl-2/Aβ-actin和 ABax/Aβ-actin值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNAi沉默Notch1基因?qū)侨饬黾?xì)胞MG63增殖的影響 mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制，抑制率與作用時(shí)間呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，相關(guān)分析顯示兩者呈正相關(guān)(r=0.994，P ＜0.01)。MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，mNotch-1 shRNA處理細(xì)胞24 h后，MG63細(xì)胞的抑制率為20%，48 h達(dá)到半數(shù)有效抑制率，在處理72 h后細(xì)胞抑制率達(dá)到最高值85%，不同時(shí)間處理組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 轉(zhuǎn)染mNotch-1 shRNA組MG63細(xì)胞的凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，在作用 24、48、72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為19.4%、37.6%、51.6%，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為9.9%。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均有明顯升高(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 Annexin V-FITC染色檢測(cè)結(jié)果

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 mNotch-1 shRNA處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MG63細(xì)胞中Notch1基因表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。另外阻斷Notch信號(hào)通路可以顯著抑制Bcl-2基因的表達(dá)并上調(diào)Bax基因的表達(dá)(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè) Notch1、Bcl-2和Bax基因的蛋白表達(dá)水平

3 討論

Notch信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，最早發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與腫瘤有關(guān)是在1991年發(fā)現(xiàn)Notch1在急性T淋巴細(xì)胞白血病中起作用，目前人們?cè)谠S多腫瘤中發(fā)現(xiàn)有 Notch信號(hào)的異常［10］。盡管Notch信號(hào)在少數(shù)腫瘤中表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，但是其信號(hào)傳導(dǎo)的活化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。治療與Notch相關(guān)的腫瘤，可以把Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路作為選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的活性靶點(diǎn)，通過阻斷Notch信號(hào)達(dá)到治療腫瘤的效果。本實(shí)驗(yàn)利用mNotch-1 shRNA處理體外培養(yǎng)的MG63細(xì)胞后，MTT結(jié)果顯示處理組細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，表明了在人骨肉瘤中阻斷Notch信號(hào)通路可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。

Kerr等于1972年首先提出細(xì)胞凋亡的概念。近年來隨著對(duì)凋亡分子機(jī)理的逐步認(rèn)識(shí)，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生是細(xì)胞增殖過度與凋亡減少導(dǎo)致過量蓄積的結(jié)果。Rieger等發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一條有效的腫瘤治療途徑。許多具有細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物都可以誘導(dǎo)凋亡，而且腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)抑制凋亡的相關(guān)基因變異，會(huì)減弱腫瘤對(duì)藥物的敏感性。本研究結(jié)果顯示，mNotch-1 shRNA處理MG63細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡增加，且隨著mNotch-1 shRNA處理的時(shí)間增加，細(xì)胞凋亡率隨之增加，與對(duì)照組比較，不同時(shí)間段均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)合MTT結(jié)果，進(jìn)一步說明RNAi沉默Notch1基因能有效誘導(dǎo)人MG63細(xì)胞凋亡。這與 Fan 等［11］、Cuevas等［12］利用 γ-分泌酶抑制劑抑制Notch信號(hào)通路可誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果相一致。

關(guān)于通過RNAi沉默Notch1基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，目前尚不十分明確。在諸多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白中，已證實(shí)Bcl-2家族基因(Bcl-2和Bax等)的活性與細(xì)胞的生存和凋亡密切相關(guān)。人Bcl-2是大小為26 kD的跨膜蛋白，通過與Bcl-2家族成員之間的相互作用調(diào)控細(xì)胞的生存與凋亡［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNAi沉默Notch1基因可以有效降低MG63細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，并上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)。而最近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，激活Notch信號(hào)通路可以抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說明RNAi沉默Notch1基因誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2家族基因的表達(dá)有關(guān)。

但由于Notch信號(hào)通路有時(shí)起抑癌作用，有時(shí)起原癌基因的作用，必須分清Notch信號(hào)通路在特定腫瘤中的作用機(jī)制。雖然有關(guān)Notch信號(hào)通路在腫瘤發(fā)病機(jī)制和腫瘤治療中的作用尚有許多問題需要回答，但隨著研究的深入，Notch信號(hào)通路作為新一類抗腫瘤治療靶點(diǎn)將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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