吳建峰，畢宏生，劉冬梅，蘇衛(wèi)華，郭俊國(guó)

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355;2山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院;3山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所)

白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后或晶狀體外傷后，殘留的晶狀體皮質(zhì)或晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)增生所形成的混濁，即后囊膜混濁(PCO)，是導(dǎo)致患者術(shù)后遠(yuǎn)期視力下降的最主要原因之一。據(jù)Sundelin等［1］統(tǒng)計(jì)，白內(nèi)障摘除術(shù)后5年內(nèi)PCO發(fā)生率為43%，術(shù)后3～5年內(nèi)有10% ～50%的患者需進(jìn)一步手術(shù)處理。目前，臨床上的主要治療手段是行YAG激光后囊膜切開(kāi)，但由于后囊破損干擾了正常的眼內(nèi)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥，如人工晶體損傷、眼內(nèi)壓升高、黃斑囊樣水腫，甚至視網(wǎng)膜脫離。因此，如能在術(shù)中采取必要措施防止PCO發(fā)生，降低并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。2010年4月～2012年3月，我們通過(guò)囊外摘除兔眼晶狀體后在晶體囊袋內(nèi)注入絲裂霉素(MMC)水凝膠，觀察其對(duì)PCO發(fā)生的抑制作用，篩選兼具療效與安全性的MMC水凝膠最佳濃度，并探討相關(guān)作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料 自制 MMC水凝膠［2，3］;健康成年新西蘭大白兔56只，雌雄不限，體質(zhì)量2～2.5 kg，均排除眼病;超聲乳化儀(U2，美國(guó)愛(ài)爾康)及相關(guān)手術(shù)器材、耗材和藥品等。

1.2 手術(shù)方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組，每組8只;右眼為手術(shù)眼，術(shù)前30 min復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)眼表面麻醉，氯胺酮、氯丙嗪25 mg/kg肌注麻醉。做3.2 mm透明角膜切口，前房?jī)?nèi)注入黏彈劑(1.5%透明質(zhì)酸鈉，上海其勝)，連續(xù)環(huán)行撕囊，直徑約 6 mm，吸出晶狀體皮質(zhì)。A組為對(duì)照組，術(shù)中不注入MMC水凝膠;B～G組為治療組，晶體皮質(zhì)吸出后，先將黏彈劑充滿前房，保護(hù)角膜及虹膜等眼內(nèi)組織;然后囊袋內(nèi)注入MMC水凝膠0.1 mL，B組和C組、D組和E 組、F 組和 G 組囊袋內(nèi)分別注入 0.2、0.4 、0.6 mg/mL的MMC水凝膠，各濃度兩組分別作用3、5 min后吸出。用10-0尼龍縫線縫合切口1針，術(shù)畢氧氟沙星滴眼液及紅霉素眼膏點(diǎn)眼。手術(shù)由同一人完成。術(shù)后予妥布霉素地塞米松滴眼液點(diǎn)眼，每日4次，連續(xù)2周。

1.3 觀察方法

1.3.1 眼前節(jié)觀察 術(shù)后第1天、3天、1周、1個(gè)月、3個(gè)月，行裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)(結(jié)膜充血程度、角膜是否水腫、切口愈合情況等)。

1.3.2 后囊膜混濁觀察 術(shù)后1天、1周、1個(gè)月、3個(gè)月，通過(guò)裂隙燈觀察并記錄后囊增殖情況;后囊膜混濁程度分級(jí):0級(jí)為透明;1級(jí)為輕度混濁，能看清眼底或混濁區(qū)面積小于1/2后囊膜面積;2級(jí)為中度混濁，能模糊見(jiàn)眼底或混濁面積大于1/2后囊膜面積;3級(jí)為完全混濁，無(wú)法看見(jiàn)眼底。

1.3.3 房水總蛋白檢測(cè) 術(shù)后第1天、1周、1個(gè)月，抽取各組術(shù)眼房水0.2 mL，用K5600微量分光光度計(jì)(KO，上海)檢測(cè)房水總蛋白含量。

1.3.4 角膜厚度測(cè)量 術(shù)后1周、1個(gè)月，采用DGH4000角膜測(cè)厚儀(JEDMED，美國(guó))進(jìn)行術(shù)眼的角膜厚度測(cè)量;每只眼測(cè)量3次，取平均值。

1.3.5 角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù) 術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月，用2000P角膜內(nèi)皮計(jì)(TOPCON，日本)對(duì)術(shù)眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)并記錄。

1.3.6 組織病理學(xué)檢查 術(shù)后3個(gè)月，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后摘除眼球，置于10%甲醛溶液固定24 h以上，流水沖洗8 h;經(jīng)梯度乙醇脫水后，進(jìn)行浸蠟、包埋、切片，HE染色后顯微鏡觀察。術(shù)后3個(gè)月，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后摘除眼球;用冷生理鹽水洗凈眼球表面后，立即置于4%的戊二醛溶液中預(yù)固定40 min;在顯微鏡下將晶狀體囊膜取出，即刻置于固定液中固定3 h以上;用PBS溶液沖洗3次，1%鋨酸固定;環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，經(jīng)鈾—鉛染色后透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行等級(jí)資料(有序多分類資料)的Logistic回歸分析、方差分析和t檢驗(yàn)等。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組術(shù)后眼前節(jié)反應(yīng)情況 術(shù)后第1天各組結(jié)膜充血均較明顯，第5～7天基本消退;各組角膜均出現(xiàn)中度混濁，并有明顯房水混濁發(fā)生，術(shù)后第7～10天消失。

2.2 各組PCO發(fā)生情況 Logistic回歸分析顯示，MMC水凝膠治療組低于對(duì)照組(P均＜0.05);各治療組間比較P均＜0.05，且MMC濃度越高，PCO發(fā)生的比例和分級(jí)越低。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后1周、1個(gè)月、3個(gè)月PCO發(fā)病情況(只)

2.3 各組術(shù)后房水蛋白含量比較 術(shù)后第1天房水總蛋白含量，治療組均高于對(duì)照組(P均 ＜0.05);治療組中，G組房水蛋白含量最高，與 D、F組比較，P均＜0.05;F組與G組、D組與E組比較，P均＜0.05。術(shù)后第1周房水總蛋白含量，治療組均高于對(duì)照組(P均＜0.05);D、F組分別與B、E、G組比較，P均 ＜0.05;術(shù)后1個(gè)月，對(duì)照組、B組、C組均與F組和 G組間有差異(P均 ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組術(shù)后房水總蛋白含量(mg/mL，ˉx±s)

2.4 各組術(shù)后角膜厚度比較 術(shù)后1周，除B組外，對(duì)照組與其余各治療組間角膜厚度比較，P均＜0.05;B組和C組、D組和E組、F組和G組比較，P均＜0.05。術(shù)后1個(gè)月，D、E、F組與對(duì)照組、B組、C組比較，P 均 ＜0.05;C、D、E、F組與 G 組比較，P均 ＜0.05。見(jiàn)表 3。

表3 各組術(shù)后角膜厚度比較(μm，ˉx±s)

2.5 各組角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見(jiàn)表4。

表4 各組術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/mm2，ˉx±s)

2.6 各組術(shù)后組織病理檢查結(jié)果 術(shù)后3個(gè)月，HE染色后角膜基本恢復(fù)正常，內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密，房角結(jié)構(gòu)正常。透射電鏡檢查顯示，對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器豐富，染色體分布均勻，呈功能活躍狀態(tài);治療組晶狀體上皮細(xì)胞不同程度體積變小，細(xì)胞表面微絨毛消失，胞質(zhì)濃縮，內(nèi)有空泡形成，線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清，染色體靠邊聚集，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。

3 討論

一般認(rèn)為，PCO的發(fā)生是術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞在各種因素作用下發(fā)生增殖、分化、移行，使后囊出現(xiàn)白色混濁，阻礙光線通過(guò)［4］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［5］，赤道部上皮細(xì)胞保留了干細(xì)胞的特性，分化活躍，具有移行性，也是PCO發(fā)生的重要區(qū)域。

由于PCO的發(fā)生受多種因素影響，隨著手術(shù)方式的改進(jìn)、人工晶體材料及設(shè)計(jì)的提高，都能在一定程度上減少其發(fā)生。但因不能徹底清除晶狀體上皮細(xì)胞，所以不能完全阻止PCO的發(fā)生。故針對(duì)引起PCO的根本原因，尋求適當(dāng)?shù)乃幬锓乐未胧?，仍是研究的重要方向。目前，治療藥物主要有抗代謝藥、纖維蛋白溶解藥等。抗代謝藥物的基本原理是抑制晶狀體上皮細(xì)胞的有絲分裂，避免對(duì)非有絲分裂的毒性作用。用于實(shí)驗(yàn)研究的藥物，有MMC、柔紅霉素、三氧化二砷、5-氟尿嘧啶、秋水仙堿等［6～8］。此類藥物均可抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖，但由于有一定的眼內(nèi)毒性，臨床應(yīng)用受到限制。其中MMC可使術(shù)后角膜內(nèi)皮明顯減少，角膜混濁明顯;柔紅霉素可在術(shù)后早期引起角膜、虹膜、睫狀體組織的炎性水腫;三氧化二砷可抑制晶狀體上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)期凋亡。纖維蛋白溶解藥肝素是較早被用做研究的藥物之一，它在臨床上已被較多使用，療效肯定，但有引起眼內(nèi)出血的可能［9］。因此，安全性和有效性是PCO防治藥物或劑型研制的關(guān)鍵問(wèn)題。

理想的藥物應(yīng)當(dāng)能有效抑制晶狀體上皮細(xì)胞增生，對(duì)眼內(nèi)其他細(xì)胞無(wú)毒性作用，且臨床用藥應(yīng)方便可行。晶狀體囊袋內(nèi)灌注用藥，可使藥物與晶狀體上皮細(xì)胞接觸而發(fā)揮其抑制作用，是最直接的用藥途徑。MMC可與DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成交聯(lián)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，抑制增殖期的DNA復(fù)制，對(duì)增殖各期細(xì)胞均有殺傷作用，同時(shí)也作用于靜止期細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨水凝膠制劑中MMC濃度增加，術(shù)后PCO發(fā)生率呈下降趨勢(shì)，且級(jí)別較低，因此認(rèn)為MMC水凝膠囊袋內(nèi)給藥對(duì)預(yù)防PCO的發(fā)生是有顯著效果的。

MMC眼內(nèi)用藥由于血眼屏障的存在，進(jìn)入血液循環(huán)的量極少，且0.05%的藥物質(zhì)量濃度遠(yuǎn)小于治療腫瘤時(shí)全身用藥劑量，故認(rèn)為囊袋內(nèi)用藥不會(huì)影響全身其他器官。眼前段用藥最直接的影響部位是角膜和虹膜，McDermott等［10］認(rèn)為，MMC對(duì)角膜的影響與質(zhì)量濃度有關(guān)。房水中的蛋白濃度是反映血—房水屏障功能的客觀指標(biāo)之一，亦是評(píng)價(jià)眼前節(jié)炎性反應(yīng)程度的依據(jù)，能夠反映MMC水凝膠對(duì)眼前節(jié)系統(tǒng)的毒副作用［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使最低濃度的MMC水凝膠也會(huì)對(duì)角膜和眼前節(jié)的血房水屏障產(chǎn)生影響，但這種影響比較輕微;在角膜內(nèi)皮計(jì)數(shù)和房水蛋白含量的變化方面，在數(shù)值上差異并不大，這也能夠解釋為何通過(guò)裂隙燈和眼前節(jié)照相系統(tǒng)觀察到的角膜水腫與眼前節(jié)炎癥反應(yīng)，對(duì)照組與治療組并無(wú)顯著差別。本實(shí)驗(yàn)將MMC制成凝膠囊袋內(nèi)給藥，即可使MMC充分與晶狀體上皮細(xì)胞接觸而發(fā)揮其抑制作用，又可以減少M(fèi)MC對(duì)眼部組織的損害;另外，注入凝膠前已在前房注入黏彈劑，即能減少藥物向囊袋外的滲漏、保護(hù)眼前節(jié)組織，又能增加MMC與囊袋的接觸時(shí)間。

本研究也顯示，0.6 mg/mL的 MMC在抑制PCO的發(fā)生方面有最佳的療效。在不同作用時(shí)間組之間的比較中又發(fā)現(xiàn)，較長(zhǎng)的MMC水凝膠留置時(shí)間，可能導(dǎo)致更明顯的角膜和血房水屏障的破壞作用，提示該制劑的眼內(nèi)留置時(shí)間以較短(3 min)為宜;同時(shí)也提示隨眼內(nèi)留置時(shí)間的增長(zhǎng)，有更多的MMC彌散至前房。因此，改進(jìn)制劑以控制這種彌散也是下一步研究的重要課題。

［1］Sundelin K，Sjostrand J.Posterior capsule opacification 5 years after extracapsular cataract extraction ［J］.J Cataract Refract Surg，1999，25(2):246-250.

［2］畢宏生，蘇衛(wèi)華，郭俊國(guó)，等.絲裂霉素C眼用凝膠的制備及質(zhì)量控制［J］.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2011，30(3):181-183.

［3］畢宏生，郭俊國(guó)，解孝鋒，等.清開(kāi)靈眼用凝膠的制備與質(zhì)量控制［J］.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2010，29(1):62-64.

［4］Apple DJ，Solomon KD，Tetz MR，et al.Posterior capsular opacification［J］.Surv Ophthalmal，1992，37(2):73-116.

［5］Peng Q，Apple DJ，Visessook N，et al.Surgical prevention of posterior capsule opacification.Part2:enhancement of cortical cleanup by focusing on hydrodissection［J］.J Cataract Refract Surg，2000，26(2):188-197.

［6］王洪濤，施玉瑛，董喆.絲裂霉素C眼內(nèi)應(yīng)用抑制后囊膜混濁的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2004，22(5):382-386.

［7］任曉冰.柔紅霉素抑制家兔后發(fā)性白內(nèi)障的形態(tài)學(xué)研究［J］.眼視光學(xué)雜志，2003，5(1):4-7.

［8］關(guān)立南，劉平，李志堅(jiān).水分離時(shí)應(yīng)用三氧化二砷抑制兔眼后囊膜混濁及其眼內(nèi)毒性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.眼科新進(jìn)展，2007，27(3):179-183.

［9］夏小平，陸道炎，王麗天，等.肝素抑制后發(fā)性白內(nèi)障形成的臨床研究［J］.中華眼科雜志，1994，30(6):405-407.

［10］McDermott ML，Wang J，Shin DH.Mitomycin and the human corneal endothelium ［J］.Arch Ophthalmal，1994，112(4):533.

［11］羅莉霞，劉奕志，張新愉，等.超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)對(duì)血—房水屏障功能的影響［J］.中華眼科雜志，2004，40(1):26-29.