張 慧， 徐 海，， 況媛媛， 宋 波， 陳龍正， 袁希漢

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014)

不結球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)起源于中國，在全國各地區(qū)尤其是南方廣泛栽培，是國內重要的綠葉菜之一［1］。根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一種世界性病害，可導致十字花科作物根和莖吸收傳導養(yǎng)分受阻，生長不良，萎蔫、矮化，產(chǎn)量和質量受損，以致減產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟損失［2-3］。近年來，由于不結球白菜栽培效益好，復種指數(shù)高，土傳病害逐漸成為制約不結球白菜發(fā)展的重要因素，根腫病由過去不常見的病害逐漸顯露出來，并呈蔓延趨勢。

目前，抗根腫病分子標記研究主要集中在結球白菜和甘藍上，在這些研究中，分別利用RAPD及RFLP等標記確定了與抗性有關的QTL［4］。在結球白菜上已經(jīng)對抗根腫病基因位點進行了定位和基因圖譜的繪制?？剐赃z傳研究發(fā)現(xiàn)，不同的生理小種抗性遺傳機制不同［5］。甘藍苗期根腫病抗性遺傳規(guī)律結果表明，抗病性受3對以上基因控制，為不完全隱性［6］;而一些研究結果表明B.napus的根腫病抗性是由1～2個獨立的顯性基因所控制，這些顯性基因在大量抗性材料中都存在［7-9］。

由于不結球白菜根腫病為土傳病害，不易控制，目前關于不結球白菜根腫病方面的研究鮮有報道。因此開發(fā)抗根腫病特異分子標記，對提高育種效率及開展分子標記輔助育種具有重要意義。本研究利用引自結球白菜根腫病抗源，與不結球白菜進行亞種間雜交，構建分離群體，試圖篩選出抗根腫病特異分子標記，并鑒別回交后代材料的根腫病抗性，為分子標記輔助育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2010年，從韓國園藝研究所引進1份結球白菜抗根腫病材料，其對根腫病表現(xiàn)為高抗。利用江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所十字花科項目組不結球白菜研究材料T青做父本進行轉育，得到F1代。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所實驗田。對F1代植株進行自交，得到F2代，F(xiàn)1代單株與不結球白菜親本回交，得到BC1代。田間管理按常規(guī)方法進行。

1.2 方法

1.2.1 各世代植株抗性鑒定 供試材料:T青、結球白菜抗源 CR、F1、F2及 BC1。每個材料3次重復，每次重復30株，隨機排列，播種于50孔穴盤。

待苗長到3～4片真葉時移栽營養(yǎng)缽，采用灌根法進行抗性鑒定。用移液器吸取1 ml含5×107或1×108個孢子懸浮液10 ml，澆注到寄主根際周圍，接菌6周后，洗凈根部泥土，調查單株發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。田間病情分級參考前人研究分級標準［3］，略有改動。分級標準為:0級，未發(fā)生病害;1級，根系的須根、側根有較少細小腫瘤，主根未發(fā)生病害;2級，根系的須根腫瘤多，側根腫瘤較多，主根發(fā)病較輕，微微腫大;3級，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側根腫瘤多;4級，根系的主根異常腫大，根系幾乎無須根。0級為抗病，其他均為感病。

1.2.2 DNA提取與檢測 采用CTAB法提取幼嫩葉片DNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度，并稀釋至 15 ng/μl。

1.2.3 抗感池的構建及引物篩選 采用BSA法，在F2群體中分別隨機選取10株抗病單株和10株感病單株，將其DNA等量混合，構建抗病基因池和感病基因池，對引物進行篩選，挑選在抗、感病池間能夠產(chǎn)生特異性條帶的引物。

1.2.4 PCR反應體系及反應程序 ISSR反應體系的總體積為20 μl，包括1 ×PCR buffer，模板 DNA 30 ng，Taq 酶 1 U、dNTP 250.00 μmol/L、引物 0.25 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L。

ISSR反應程序為94℃預變性5 min;94℃變性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，循環(huán)35次;72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.5 瓊脂糖電泳分離 反應結束后，PCR產(chǎn)物點入含0.5 μg/ml EB的2.0% 瓊脂糖凝膠中，以DNA marker V(Tiangen)作為分子量標準，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，紫外凝膠成像儀下照相。

1.2.6 ISSR標記的連鎖分析 將篩選出的 ISSR標記在雙親及F2分離群體中進行驗證，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。親本為抗病有標記帶和感病無標記帶，F(xiàn)1代為感病有標記帶，F(xiàn)2代中重組型個體為抗病無標記帶、雜合感病無標記帶和純合感病有標記帶，根據(jù)F2代中重組型單株的數(shù)量計算交換率，再根據(jù)Kosambi作圖函數(shù)公式換算成Morgan遺傳距離。

2 結果

2.1 抗根腫病群體抗性鑒定

表1 親本、F1、F2和BC1群體對根腫病的抗性Table 1 Resistance to clubroot in parental lines，F(xiàn)1，F(xiàn)2and BC1

2.2 分子標記的篩選

用90條ISSR引物進行親本PCR擴增，其中21條ISSR引物可以在親本間穩(wěn)定擴增出清晰多態(tài)性條帶，占總引物數(shù)的23.0%。將能夠擴增到清晰多態(tài)性條帶的引物在抗感池中篩選，結果發(fā)現(xiàn)，引物873(5'-GACAGACAGACAGACA-3')可以在抗感基因池中擴增出多態(tài)性條帶，差異片段分別約為500 bp(圖1)。

圖1 引物873對親本和抗感DNA池的PCR電泳圖譜Fig.1 The electrophoresis pattern of parents and DNA pools by primer 873

由于抗根腫病基因是顯性基因，如果標記與抗病基因緊密連鎖，純合抗病株和雜合抗病株都能擴增出此帶，而純合感病株應沒有此帶。利用F2分離群體中的73個單株DNA對候選引物進一步驗證，結果(圖2)顯示，標記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級)中，53個擴增出差異條帶，1個未擴增出差異條帶。同樣19份感病單株中，有6份擴增產(chǎn)生特異條帶。因此共有7株在標記873與抗病基因之間發(fā)生重組，交換率為9.59%。依據(jù)Kogambi作圖函數(shù)公式得出標記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9.72 cM，命名為CR-873。

圖2 引物873對F2部分單株的擴增圖譜Fig.2 The PCR pattern of individuals of F2by primer 873

3 討論

根腫病抗性(Clubroot resistance，CR)的遺傳機制研究主要集中在白菜、甘藍、甘藍型油菜這3類蕓薹屬作物中。Laurens等認為，甘藍的根腫病抗性由許多主效的等位基因所控制，這些等位基因是不完全顯性的，并具有明顯的加性遺傳效應［10］。Voorrips等認為控制甘藍根腫病抗性的基因都是隱性基因［11］。在B.rapa中發(fā)現(xiàn)了至少3個主要的根腫病抗性基因，這些基因是相對獨立的，且分別對不同的P.brassicae 生理小種發(fā)生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發(fā)現(xiàn)了B.napus根腫病抗性由1個主效基因和至少2個隱性基因控制［15］。王芳展等認為，B.rapa大多數(shù)抗性基因都來自于歐洲飼料蕪菁，不同的品種獲得了1個或者多個的抗性基因，而這些基因之間又相對保持獨立［16］。本研究通過對抗根腫病多世代群體進行抗性鑒定表明，不結球白菜抗性由顯性單基因控制。

Matsumoto等發(fā)現(xiàn)了2個RFLP標記與1個CR基因CRa連鎖，并將其定位在 R3染色體34 cM的位置上［17］。Suwabe等利用 SSR標記，發(fā)現(xiàn)了Crr1和Crr2 2個CR位點［18］。Kuginuki等利用Siloga作為抗源，發(fā)現(xiàn)了3個RAPD標記與CR位點連鎖［19］。ISSR技術可以比RFLP、SSR、RAPD等技術更多地揭示基因組中的多態(tài)性，并比RAPD穩(wěn)定，比AFLP簡便，是一種很好的DNA指紋標記。本研究采用BSA和ISSR技術相結合來研究與不結球白菜抗根腫病基因連鎖的標記，得到1個與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標記CR-873，遺傳距離為9.72 cM。本研究中得到的CR-873標記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠，可能是因為本研究中用于計算遺傳距離的群體偏小，一定程度上影響遺傳距離的準確性。后續(xù)研究可以進一步擴大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標記轉換為更穩(wěn)定的SCAR標記。

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