周淼平， 周小青， 姚金保， 張?jiān)銎G， 張 鵬， 楊學(xué)明， 馬鴻翔

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081)

MYB蛋白是植物中數(shù)量最多且功能最多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與調(diào)控植物細(xì)胞周期、器官形態(tài)建成、次生代謝以及對(duì)逆境脅迫反應(yīng)的應(yīng)答，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)的不同可將其劃分為MYB1R、R2R3-MYB、R1R2R3MYB以及4RMYB 等4類［1］。目前MYB基因及其功能在擬南芥、水稻和棉花等作物中已進(jìn)行了廣泛研究［1-2］。小麥中MYB基因功能的研究相對(duì)滯后，目前發(fā)現(xiàn)的MYB基因多參與干旱和鹽害等非生物逆境脅迫反應(yīng)。Chen等［3］克隆了23個(gè)MYB基因片段，但僅有6個(gè)得到完整開放閱讀框，用30%PEG處理后，6個(gè)MYB基因表達(dá)特性各不相同。Cai等［4］通過小麥EST序列電子克隆了36個(gè)R2R3-MYB型MYB基因。王轉(zhuǎn)等［5］從小麥水分脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA文庫中檢測(cè)到2個(gè)MYB基因。利用TaMyb2基因特異引物，賈東升等［6］克隆了3種類型TaMyb2的cDNA序列，轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果表明，TaMYB2A基因可以抵御干旱、鹽以及冷害的脅迫［7］。Rahaie等［8］分析了 10 個(gè)MYB基因?qū)}和干旱脅迫的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)4個(gè)MYB基因在短期鹽脅迫后小麥根部表達(dá)上調(diào)，3個(gè)MYB基因在長期鹽脅迫后基因表達(dá)上調(diào)，其中TaMYBsdu1基因受長期干旱脅迫后在小麥的根和葉中顯著上調(diào)，可能是小麥對(duì)鹽和干旱脅迫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子。Zhang等［9］克隆了60個(gè)小麥MYB基因并進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TaMYB32基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。同樣TaMYB73在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)也增加了對(duì)鹽脅迫的抵御［10］。這些研究表明，MYB在植物的抗旱耐鹽中具有重要作用。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所根據(jù)擬南芥AtMYB108基因同源小麥EST序列克隆了小麥TaPIMP1基因，該基因具有典型的MYB基因特點(diǎn)。我們將該基因?qū)胄←湏P(yáng)麥158，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的紋枯病抗性有所提高［11］。由于AtMYB108基因不僅參與擬南芥抗病性的調(diào)節(jié)，同時(shí)也參與擬南芥的抗逆反應(yīng)，所以轉(zhuǎn)基因株系的抗旱耐鹽性有沒有提高值得關(guān)注。本研究擬采用轉(zhuǎn)基因純合株系，通過模擬干旱處理，對(duì)部分耐旱性狀指標(biāo)進(jìn)行初步分析，以探討該基因在小麥耐旱轉(zhuǎn)基因種質(zhì)培育方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因材料

純合轉(zhuǎn)TaPIMP1基因小麥株系B64和B208以及轉(zhuǎn)基因受體對(duì)照揚(yáng)麥158由本研究室保存。

1.2 模擬干旱對(duì)小麥TaPIMP1基因表達(dá)的影響

將揚(yáng)麥158、B64和B208的1葉1心幼苗置于含20%(質(zhì)量體積比)PEG6000的Hogland營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫處理，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、24 h各取5株葉片樣品，等量混合，液氮中磨碎，采用AxyPre RNA提取試劑盒(Promega公司)提取RNA，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR@GreenI(TaKaRa公司)在LightCycler2.0熒光定量PCR儀(Roche公司)上進(jìn)行，內(nèi)參照基因采用actin基因，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。TaPIMP1基因擴(kuò)增引物為5'-ACGGACAACGAGGTCAAGAAC-3'和5'-GAAATGGGCTCCGTGCG-3';actin基因擴(kuò)增引物為5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3'和5'-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3'。

1.3 模擬干旱對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

選取籽粒飽滿、大小一致的揚(yáng)麥158、B64和B208種子，分別于無菌水和無菌水配置的20%(質(zhì)量體積比)PEG6000溶液中浸泡12 h后，轉(zhuǎn)移至墊有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿50粒左右，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗萌發(fā)，3 d后計(jì)算發(fā)芽率。

選取在無菌水中萌發(fā)露白的揚(yáng)麥158、B64和B208種子置于墊有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，分別添加無菌水和20%(質(zhì)量體積比)PEG6000溶液20 ml，于25℃、70%濕度的植物生長箱中培養(yǎng)7 d后，測(cè)量胚芽鞘長度、胚根長度，同時(shí)調(diào)查胚根數(shù)。

1.4 模擬干旱對(duì)相關(guān)生化指標(biāo)的影響

取形態(tài)長勢(shì)一致的5葉期對(duì)照植株和轉(zhuǎn)基因株系植株，洗凈根部后置于1/2MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，再移入含0、5%、10%、15%和20%(質(zhì)量體積比)PEG6000的營養(yǎng)液中進(jìn)行不同強(qiáng)度模擬干旱處理，12 h后測(cè)定葉片相對(duì)含水量、可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量以及過氧化物酶(POD)活性。

1.4.1 小麥葉片相對(duì)含水量的測(cè)定 參照Siddigue等［12］方法進(jìn)行，計(jì)算公式為:相對(duì)含水量=(鮮質(zhì)量－干質(zhì)量)/(飽和質(zhì)量－干質(zhì)量)×100%。

葉片鮮質(zhì)量在取樣后2 h內(nèi)測(cè)定，將葉片于20℃蒸餾水中浸泡18 h后測(cè)定飽和質(zhì)量，70℃烘箱中烘烤72 h后測(cè)定干質(zhì)量。

1.4.2 葉片可溶性糖 按張志安等的方法［13］進(jìn)行，取0.3 g葉片，置于10 ml蒸餾水中，沸水浴30 min，提取液過濾，并定容至25 ml。吸取0.5 ml提取液于試管中，依次加入蒸餾水1.5 ml、9%苯酚1.0 ml和濃硫酸5.0 ml，搖勻，室溫下放置30 min顯色，485 nm波長下測(cè)定光密度，計(jì)算可溶性糖含量。

1.4.3 葉片MDA含量 采用張志安等方法［13］，取1 g葉片，采用石英砂于2 ml 5%TCA中研磨至勻漿，加入8 ml 5%TCA進(jìn)一步研磨，勻漿以4 000 r/min離心10 min，吸取上清 2 ml，加入 2 ml 0.6%TBA溶液，混勻，沸水浴10 min，3 000 r/min離心15 min，上清測(cè)定532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光度值。提取樣品中 MDA濃度，由 C(μmol/L)=6.45(A532－A600)－0.56A450公式計(jì)算，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)換算成葉片中MDA含量。

1.4.4 葉片 POD活性 按張志安等方法［13］進(jìn)行，取1 g葉片于研缽中，加適量磷酸緩沖液研成勻漿，4 000 r/min離心15 min，上清定容至100 ml;于比色杯中加入反應(yīng)混合液3 ml和上述提取酶液1 ml，測(cè)量波長470 nm下的吸光度值，每隔1 min讀數(shù)1次。POD活性以1 min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位(U)。根據(jù)一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化、取樣質(zhì)量和提取液稀釋倍數(shù)計(jì)算POD活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 模擬干旱脅迫對(duì)小麥TaPIMP1基因表達(dá)的影響

PEG6000模擬干旱處理前，對(duì)照揚(yáng)麥158的TaPIMP1基因有一定的本底表達(dá)，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系B208和B64的表達(dá)水平基本一致，明顯比揚(yáng)麥158的表達(dá)水平高，主要是因?yàn)閷?dǎo)入的TaPIMP1基因由玉米u(yù)biquitin組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)維持了一定量的表達(dá)(圖1)。20%PEG6000處理時(shí)，對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系的TaPIMP1基因均經(jīng)歷了明顯的先下調(diào)再逐漸上調(diào)的過程，處理24 h，轉(zhuǎn)基因株系B64的表達(dá)明顯高于B208和對(duì)照揚(yáng)麥158。先前的研究表明，TaPIMP1基因表達(dá)與小麥水分虧缺相關(guān)，干旱處理后，小麥TaPIMP1基因表達(dá)明顯上調(diào)［14］。本研究模擬干旱處理采用的是1葉1心期的幼苗，是否由于生長時(shí)期的不同而導(dǎo)致TaPIMP1基因的表達(dá)方式產(chǎn)生一定的差異，有待進(jìn)一步探討。但干旱處理引起TaPIMP1基因表達(dá)的劇烈波動(dòng)，表明該基因與小麥的耐旱性有關(guān)聯(lián)。

圖1 模擬干旱處理后轉(zhuǎn)基因株系及其對(duì)照TaPIMP1基因的表達(dá)分析Fig.1 Expressions of TaPIMP1 gene in transgenic lines(B208 and B64)and control(Yangmai 158)after treatment of PEG6000 osmotic stress

2.2 模擬干旱脅迫對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

20%PEG6000脅迫處理后，對(duì)照揚(yáng)麥158種子的萌發(fā)受到明顯抑制，發(fā)芽率由100%下降到68.5%;脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)影響較小，B64株系發(fā)芽率仍為100%，B208株系雖然由100%下降到83.3%，但仍然極顯著高于揚(yáng)麥158，表明轉(zhuǎn)基因株系在種子萌發(fā)時(shí)期的耐旱能力比受體對(duì)照有所提高。

PEG6000脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和受體對(duì)照幼苗的胚根數(shù)影響不明顯，但胚芽鞘和胚根的伸長受到嚴(yán)重抑制。2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系胚芽鞘和胚根的伸長明顯好于對(duì)照揚(yáng)麥158(表1)，表明轉(zhuǎn)基因株系幼苗對(duì)干旱的耐受能力優(yōu)于揚(yáng)麥158。

表1 PEG6000脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和受體對(duì)照種子萌發(fā)后生長形態(tài)指標(biāo)的影響Table 1 Effects of PEG6000 osmotic stress on seedling growth of transgenic plant(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.3 模擬干旱脅迫對(duì)葉片相對(duì)含水量的影響

采用不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫處理12 h，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系B64和B208與對(duì)照揚(yáng)麥158的表現(xiàn)不盡相同。在0～15%濃度下，對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系之間的表型變化差異不大，B64株系植株生長狀況稍好，但在20%的濃度下，受體對(duì)照揚(yáng)麥158植株的萎蔫程度明顯比轉(zhuǎn)基因株系嚴(yán)重。

取模擬干旱處理后的小麥葉片，測(cè)定葉片相對(duì)含水量，發(fā)現(xiàn)5%低濃度處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照差異不明顯，10% ～20%濃度下，對(duì)照揚(yáng)麥158葉片相對(duì)含水量明顯低于轉(zhuǎn)基因株系(表2)。植物組織含水量對(duì)植物的生理活動(dòng)有重要影響，干旱的直接作用就是引起植物組織失水，導(dǎo)致各種代謝活動(dòng)的生長紊亂，相對(duì)含水量是評(píng)價(jià)干旱脅迫程度的穩(wěn)定參數(shù)［15］。轉(zhuǎn)基因株系葉片相對(duì)含水量明顯高于揚(yáng)麥158，表明轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性好于受體對(duì)照。

表2 轉(zhuǎn)基因小麥株系和受體對(duì)照葉片相對(duì)含水量比較Table 2 Comparison of relative water content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.4 模擬干旱脅迫對(duì)葉片可溶性糖含量的影響

干旱脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性糖會(huì)大量積累，以緩解外界脅迫對(duì)植物造成的傷害［16-20］。由表3可以看出，當(dāng)PEG6000濃度為5%時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系B64和B208與對(duì)照揚(yáng)麥158的可溶性糖含量差異不大;隨著PEG6000濃度的提高，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照的可溶性糖含量都有增加趨勢(shì);當(dāng)濃度達(dá)到10%時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照的可溶性糖含量差異達(dá)到顯著水平;當(dāng)濃度達(dá)到20%時(shí)，轉(zhuǎn)基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量比未干旱脅迫處理分別增加了1.43倍和1.29倍，對(duì)照植株增加1.04倍，轉(zhuǎn)基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量分別是對(duì)照揚(yáng)麥158的1.47倍和1.29倍，顯示轉(zhuǎn)基因株系對(duì)干旱脅迫的緩解能力有所提升。

表3 轉(zhuǎn)基因小麥株系和受體對(duì)照葉片可溶性糖含量比較Table 3 Comparison of soluble sugar in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.5 模擬干旱脅迫對(duì)葉片MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一，其含量可以表示膜脂過氧化作用的程度。由表4可以看出，不同濃度PEG6000脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系B64和B208和對(duì)照揚(yáng)麥158的葉片MDA含量均呈增加趨勢(shì)，表明干旱脅迫對(duì)受試株系的膜系統(tǒng)造成了傷害，并且濃度愈高傷害愈重。5%PEG6000處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照葉片的MDA含量就出現(xiàn)了顯著差異。不同濃度PEG6000處理，轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量都沒有超過對(duì)照;20%濃度處理時(shí)，受體對(duì)照植株揚(yáng)麥158的MDA含量已經(jīng)是未脅迫處理的2.8倍，而轉(zhuǎn)基因株系B64和B608的MDA含量是未脅迫處理的1.8倍，表明轉(zhuǎn)基因株系的膜脂受損程度比對(duì)照小，也從側(cè)面說明轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力優(yōu)于受體對(duì)照。

表4 轉(zhuǎn)基因小麥株系和受體對(duì)照葉片丙二醛含量比較Table 4 Comparison of MDA content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.6 模擬干旱脅迫對(duì)葉片POD活性的影響

正常情況下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡遭到破壞，自由基便產(chǎn)生積累，POD是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除H2O2的主要酶類之一，它能催化H2O2氧化其他底物后產(chǎn)生H2O。由表5可知，在不同濃度PEG6000脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系B64和B208和對(duì)照揚(yáng)麥158葉片的POD活性呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢(shì)，不同處理轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照的POD活性差異沒有達(dá)到顯著水平。

表5 轉(zhuǎn)基因小麥株系和受體對(duì)照葉片POD活性比較Table 5 Comparison of POD activity in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

3 討論

MYB蛋白是植物的重要調(diào)控因子，部分MYB基因參與植物的抗旱調(diào)節(jié)。例如厚葉旋蒴苣苔中的BcMYB1可通過不依賴ABA的途徑參與調(diào)控基因表達(dá)，從而對(duì)干旱產(chǎn)生應(yīng)答，該基因同時(shí)也能對(duì)PEG、高鹽、低溫等脅迫產(chǎn)生一定程度的應(yīng)答［21］。擬南芥的AtMYB2基因在干旱脅迫下，可作為ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮作用，在其他一些逆境誘導(dǎo)下AtMYB2表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)，干旱應(yīng)答基因rd22和AtADH1的表達(dá)也得到加強(qiáng)［22］。AtMYB60參與植物的耐旱脅迫過程也被證實(shí)［23］。TaPIMP1基因是根據(jù)擬南芥AtMYB108小麥同源EST序列克隆而來，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtMYB108除了可抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和黑斑病菌(Alternaria brassicicola)等病原真菌的生長，還受高鹽、干旱、氧脅迫及外源ABA誘導(dǎo)［24］。本研究結(jié)果表明，TaPIMP1基因也參與了小麥對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答，TaPIMP1基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系在模擬干旱條件下，其種子的萌發(fā)、幼苗的生長以及成株期葉片的相對(duì)含水量、可溶性糖含量、MDA含量等指標(biāo)均優(yōu)于受體對(duì)照揚(yáng)麥158，表明TaPIMP1基因的組成型表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性。

中國水資源短缺，人均水資源只有世界平均的1/4。農(nóng)業(yè)用水占中國用水總量的70%，但農(nóng)業(yè)灌溉水平均利用率低，不及發(fā)達(dá)國家的一半。在中國北方，小麥用水已占農(nóng)業(yè)用水的70%，因此，節(jié)水已成為中國北方小麥生產(chǎn)的重要研究課題［25］。小麥生產(chǎn)中除了采取節(jié)水栽培和管理措施外，耐旱小麥品種的培育和應(yīng)用非常關(guān)鍵。優(yōu)良小麥品種的培育需要特異種質(zhì)材料的支撐，除了加強(qiáng)從小麥及其近緣的種質(zhì)材料中篩選優(yōu)異抗旱節(jié)水種質(zhì)材料外，拓寬與抗旱節(jié)水相關(guān)優(yōu)異基因的發(fā)掘范圍也非常重要，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段之一。高世慶等［26］將大豆GmDREB基因?qū)媵旣?2號(hào)中，轉(zhuǎn)基因小麥能在10%PEG6000模擬干旱培養(yǎng)基上正常發(fā)芽生長;在18%PEG6000溶液處理后，轉(zhuǎn)基因小麥的發(fā)芽率比對(duì)照明顯提高。將大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的融合基因TPSP導(dǎo)入小麥，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥的海藻糖含量大幅提高;20%PEG6000溶液處理后，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量較對(duì)照明顯提高，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力［27-28］。將棉花GhDREB導(dǎo)入魯麥23中也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照具有更強(qiáng)的抗旱節(jié)水性能［29］。轉(zhuǎn)TaEBP基因小麥株系的抗旱節(jié)水性能也明顯高于受體對(duì)照寧春9號(hào)［30］。我們將由玉米u(yù)biquitin組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的小麥MYB蛋白基因TaPIMP1導(dǎo)入揚(yáng)麥158，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的耐旱能力較受體對(duì)照有所提高。這些研究表明，轉(zhuǎn)基因方法可以作為常規(guī)育種方法的補(bǔ)充和延伸，該方法能打破物種間的界限，將其他物種的有利基因引入到小麥中，提高小麥的耐旱性。

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