王冬蘭， 簡(jiǎn) 秋， 柯昌杰， 宋穩(wěn)成， 孫 星， 汪佳蕾， 楊邦保

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(南京)，江蘇 南京 210014;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

葡萄是世界“四大果樹(shù)”之一，也是重要果樹(shù)種類(lèi)［1］。中國(guó)葡萄生產(chǎn)發(fā)展速度居國(guó)內(nèi)果品之首［2］，截至2010年底，葡萄栽培總面積5.2×104hm2，居第6位，僅次于柑橘、蘋(píng)果、梨、桃和荔枝［3］;總產(chǎn)量8.548 9×106t，居第6位，僅次于蘋(píng)果、柑橘、梨、桃和香蕉［4］。隨著國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的啟動(dòng)與實(shí)施，中國(guó)在葡萄栽培種植科研方面取得了較大進(jìn)展，有力地推動(dòng)了葡萄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。由于葡萄種植具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、病蟲(chóng)害種類(lèi)多等特點(diǎn)，因此農(nóng)藥殘留是影響葡萄質(zhì)量安全與消費(fèi)者健康的主要因素之一。嘧菌環(huán)胺為嘧啶胺類(lèi)內(nèi)吸性殺菌劑，主要是在病原真菌的侵入期和菌絲生長(zhǎng)期施用，通過(guò)抑制蛋氨酸的生物合成和水解酶的生物活性，導(dǎo)致病菌死亡。嘧菌環(huán)胺可迅速被植物葉面吸收，具有較好的保護(hù)性和治療活性，可防治谷物、蔬菜和水果等多種作物的灰霉?。?－8］。目前中國(guó)尚未制定嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)值(MRL)，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)制定其在葡萄中的MRL值為3 mg/kg。本試驗(yàn)擬開(kāi)展嘧菌環(huán)胺在葡萄上的殘留規(guī)律研究，為制定其在葡萄上的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，指導(dǎo)該藥在葡萄生產(chǎn)中的合理使用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 Agilent－1200型液相色譜儀 (配有 DAD檢測(cè)器)，色譜柱為 Agilent extend－C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純;超純水為標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞95%，德國(guó)ACROS公司產(chǎn)品);N－丙基乙二胺鍵合固相吸附材料(PSA)購(gòu)于DIMA Technology Inc.Richmond Hill，USA;無(wú)水硫酸鎂(北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品)在500℃馬弗爐中烘5 h;嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度98%;50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑為市售。

1.1.3 標(biāo)樣的配制 精確稱(chēng)取嘧菌環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.1 mg)，甲醇定容至50.0 ml，配成標(biāo)準(zhǔn)母液。再用空白葡萄和土壤的提取液配制成0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃冰箱中備用。

1.2 田間試驗(yàn)

按照《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》［9］，于2012年分別在北京市、江蘇省南京市、山東省煙臺(tái)市3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行殘留試驗(yàn)。各試驗(yàn)點(diǎn)分別設(shè)葡萄低劑量(800 mg/kg，a.i.)、葡萄高劑量(1 200 mg/kg，a.i.)兩個(gè)施藥劑量。每個(gè)劑量再設(shè)施藥3次、4次(間隔7 d施藥1次)2個(gè)施藥次數(shù)。同時(shí)設(shè)葡萄殘留消解動(dòng)態(tài)和土壤消解動(dòng)態(tài)2個(gè)試驗(yàn)，均為1 200 mg/kg，a.i.，各施藥1次，每個(gè)處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積20 m2，用于殘留動(dòng)態(tài)試驗(yàn)的葡萄系繩標(biāo)記，同時(shí)設(shè)不施藥對(duì)照小區(qū)。

最終殘留試驗(yàn)處理中葡萄和土壤樣品的采收:在最后一次施藥后7 d、14 d和21 d后，隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集6串以上(不少于2 kg)生長(zhǎng)正常、無(wú)病害、成熟的葡萄;同時(shí)用土壤采樣器在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選6～12采樣點(diǎn)，采集地表以下0～15 cm土壤。

葡萄殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)處理中葡萄樣品的采收:于施藥后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d采用隨機(jī)方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)不同方向及上下不同部位采集6串以上生長(zhǎng)正常、無(wú)病害、成熟的系繩標(biāo)記過(guò)的葡萄(不少于2 kg)。

土壤殘留消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)處理中土壤樣品的采收:于施藥后 0 d(2 h)、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d隨機(jī)選10點(diǎn)以上用土壤取樣器取0～10 cm深土樣1 kg左右。

1.3 樣品制備

將采集到的葡萄樣本用搗碎機(jī)搗碎，裝入密封袋中，貯存于－20℃冰箱內(nèi)待分析。將采集到的土壤樣本混合均勻，貯存于－20℃冰箱內(nèi)待分析。

1.4 殘留分析方法

1.4.1 提取方法 稱(chēng)取搗碎的葡萄樣本15.0 g或土壤樣本10.0 g于離心管中，加入乙腈15 ml，渦旋振蕩1 min，然后加入1.5 g NaCl和6 g MgSO4渦旋1 min，4 000 r/min離心 5 min，取上層清液 1 ml到稱(chēng)有150 mg無(wú)水MgSO4和50 mg PSA的2 ml離心管中，渦旋30 s，取500 μl上清液過(guò) 0.22 μm 濾膜到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，待測(cè)［10－12］。

1.4.2 液相色譜檢測(cè)條件 流動(dòng)相:使用梯度洗脫模式，甲醇∶水=60∶40(體積比)，保持1 min，在1～15 min變換到甲醇∶水=70∶30(體積比)，保持20 min。檢測(cè)器波長(zhǎng):270 nm;流速:1.0 ml/min;進(jìn)樣量:20 μl［10－12］。

2 結(jié)果

2.1 回收率與最低檢出限

采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。分別在空白葡萄或土壤樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的嘧菌環(huán)胺標(biāo)樣(0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、1.00 mg/kg)，按上述提取、凈化和儀器分析步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平重復(fù)5次。嘧菌環(huán)胺相對(duì)保留時(shí)間為12.7 min左右。添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明，嘧菌環(huán)胺在葡萄中平均回收率為81.1%～92.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8% ～9.0%;在土壤中平均回收率為80.1% ～91.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0% ～9.7%(表1)。該方法對(duì)葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺殘留的最低檢出限均為0.05 mg/kg。該方法符合NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》的要求［13］。

表1 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的添加回收率(n=5)Table 1 Recoveries of cyprodinil in grape and soil(n=5)

2.2 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)

嘧菌環(huán)胺在北京市、江蘇省南京市和山東省煙臺(tái)市3個(gè)不同試驗(yàn)點(diǎn)葡萄和土壤中的殘留消解動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖1，降解動(dòng)力學(xué)方程見(jiàn)表2。嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤樣品中的降解計(jì)算采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程式(Ct=C0e－kt)［14－15］。試驗(yàn)結(jié)果表明，在施藥當(dāng)天，嘧菌環(huán)胺在各試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中的殘留量為1.16～2.43 mg/kg，在土壤中的殘留量為0.85～4.21 mg/kg，隨著采樣時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄中嘧菌環(huán)胺的含量均降低。嘧菌環(huán)胺在不同試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中的原始沉積量差異較大(北京:2.43 mg/kg;江蘇:1.16 mg/kg;山東:1.84 mg/kg)。由葡萄品種不同而引起的葡萄表面積差異能導(dǎo)致農(nóng)藥在葡萄上的殘留量有明顯差異，由不同試驗(yàn)點(diǎn)的葡萄種植密度不同而導(dǎo)致的農(nóng)藥用量不同也能引起農(nóng)藥在葡萄上殘留量出現(xiàn)差異。同時(shí)，施藥的天氣條件，如溫度、相對(duì)濕度、風(fēng)速等也能導(dǎo)致嘧菌環(huán)胺在不同試驗(yàn)點(diǎn)葡萄上原始沉積量存在差異。施藥后5 d，嘧菌環(huán)胺在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中的降解率均達(dá)到50%以上。施藥后14 d，嘧菌環(huán)胺在葡萄中的降解率均達(dá)到了90%以上。施藥后5 d，嘧菌環(huán)胺在3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)種植葡萄土壤中降解率也均超過(guò)了80%。從表2可以看出，嘧菌環(huán)胺在山東省煙臺(tái)市試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中的半衰期最長(zhǎng)(4.2 d)，在江蘇省南京市試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中的半衰期最短(1.7 d)。嘧菌環(huán)胺在北京試驗(yàn)點(diǎn)土壤中的半衰期最長(zhǎng)(4.1 d)，在江蘇南京試驗(yàn)點(diǎn)土壤中的半衰期最短(3.1 d)。

表2 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的消解動(dòng)力學(xué)方程Table 2 Degradation equations of cyprodinil in grape and soil

圖1 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的殘留消解動(dòng)態(tài)Fig.1 Degradation dynamics of cyprodinil in grape and soil

2.3 嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤中的最終殘留

按低劑量、高劑量分別施藥3次和4次后，在距最后一次施藥7 d、14 d和21 d時(shí)葡萄和土壤樣品中嘧菌環(huán)胺殘留量見(jiàn)表3和表4。嘧菌環(huán)胺在葡萄中的殘留量為 0.05～3.85 mg/kg。低劑量和高劑量施藥3次和4次處理，在最后一次施藥后21 d，葡萄中嘧菌環(huán)胺均低于2 mg/kg(美國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn))。在相同施藥劑量和施藥次數(shù)條件下，隨著采樣間隔期的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量隨之下降;在相同采收間隔期和施藥次數(shù)條件下，各試驗(yàn)點(diǎn)高劑量處理葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量均高于低劑量處理;在相同采收間隔期和施藥劑量條件下，各試驗(yàn)點(diǎn)葡萄中嘧菌環(huán)胺的殘留量隨著用藥次數(shù)的增加而增加。種植葡萄地的土壤中嘧菌環(huán)胺的含量為0.11 ～3.21 mg/kg。

表3 嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最終殘留量Table 3 Final residue levels of cyprodinil in grape

表4 嘧菌環(huán)胺在土壤中的最終殘留量Table 4 Final residue levels of cyprodinil in soil

3 討論

嘧菌環(huán)胺是一種蛋氨酸生物合成抑制劑，與三唑類(lèi)、咪唑類(lèi)、嗎啉類(lèi)、苯基吡咯類(lèi)等無(wú)交互抗性，具有預(yù)防和治療作用。目前在中國(guó)已有7個(gè)農(nóng)藥產(chǎn)品取得了臨時(shí)登記，每日允許攝入量(ADI)為0.03 mg/(kg·bw)。目前中國(guó)尚未制定相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中嘧菌環(huán)胺的最大殘留限量(MRL)。CAC殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中嘧菌環(huán)胺在葡萄上的MRL值均為3 mg/kg，日本為5 mg/kg，美國(guó)為2 mg/kg。為保障消費(fèi)者的安全和促進(jìn)貿(mào)易，有必要研究嘧菌環(huán)胺在中國(guó)不同典型葡萄種植區(qū)域的殘留規(guī)律和最終殘留量，為盡快制定其在相關(guān)作物上的MRL及評(píng)估殘留風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

本研究所建立的葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺殘留分析方法檢出限(0.05 mg/kg)低，前處理方法簡(jiǎn)便且效率高，完全能夠滿(mǎn)足市場(chǎng)監(jiān)測(cè)和農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)中嘧菌環(huán)胺殘留的檢測(cè)。嘧菌環(huán)胺按高低兩個(gè)施藥劑量，分別施藥3次和4次，21 d后采樣，葡萄中嘧菌環(huán)胺殘留量均低于 2 mg/kg，參照 CAC(3 mg/kg)、美國(guó)(2 mg/kg)和日本(5 mg/kg)制定的葡萄中嘧菌環(huán)胺的MRL，按本試驗(yàn)中劑量施藥21 d后采收葡萄是安全的。

［1］河北農(nóng)業(yè)大學(xué).果樹(shù)栽培學(xué)各論:北方本［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1987.

［2］毋永龍，聶繼云，李海飛，等.遼西主產(chǎn)區(qū)葡萄的根區(qū)土壤養(yǎng)分研究［J］. 土壤通報(bào)，2013，44(1):138－143.

［3］王海波，王孝娣，郝志強(qiáng)，等.我國(guó)葡萄栽培科研進(jìn)展［J］.中國(guó)果樹(shù)，2013(1):62－64，67.

［4］呂佩坷，蘇慧蘭，高振江，等.中國(guó)現(xiàn)代蔬菜病蟲(chóng)原色圖譜［M］.呼和浩特:遠(yuǎn)方出版社，2008:561－566.

［5］段瑞華，張明法，李 毅，等.30%甲基硫菌靈·嘧菌環(huán)胺懸浮劑防治水稻稻瘟病藥效研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(4):194.

［6］宋巧鳳.50%嘧菌環(huán)胺WDG防治草莓灰霉病田間試驗(yàn)［J］.上海蔬菜，2012(6):57－58.

［7］郭彩霞，謝克虎，遲曉紅，等.50%嘧菌環(huán)胺WG防治櫻桃番茄灰霉病田間藥效試驗(yàn)［J］.北方園藝，2010(16):163－164.

［8］FANG C C，CHEN F Y，CHEN C R，et al.Cyprodinil as an activator of aryl hydrocarbon receptor［J］.Toxicology，2013，304:32－40.

［9］農(nóng)藥部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［M］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［10］OTERO R R，RUIZ C Y，GRANDE C B，et al.Solid－phase microextraction－gas chromatographic－mass spectrometric method for the determination of the fungicides cyprodinil and fludioxonil in white wines［J］.Journal of Chromatography A，2002，942:41－52.

［11］FENOLL J，RUIZ E，HELLíN P，et al.Dissipation rates of insecticides and fungicides in peppers grown in greenhouse and under cold storage conditions［J］.Food Chemistry，2009，113:727－732.

［12］EVA P J，BEATRIZ C G，RAQUEL R O，et al.The dissipation rates of cyprodinil，fludioxonil，procymidone and vinclozoline during storage of grape juice ［J］.Food Control，2006，17:1012－1017.

［13］NY/T 788—2004.農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則［S］.

［14］張志勇，王冬蘭，張存政，等.苯醚甲環(huán)唑在水稻和稻田中的殘留［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2011，25(3):339－392.

［15］GAO J P，GARRISON W，HOEHAMER C，et al.Uptake and phytotransformation of organophosphorus pesticides by axenically cultivated aquatic plants［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48:6114－6120.