李鵬成， 孫 冰， 喬緒穩(wěn)， 鄭其升， 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

乳球菌外殼-蛋白錨定系統(tǒng)是一種新型的疫苗 載運(yùn)系統(tǒng)。乳球菌外殼實(shí)際上是經(jīng)過熱酸處理后得到的球形肽聚糖基質(zhì)(Gram-positive enhancer matrix，GEM)，表面通過一種肽聚糖錨鉤蛋白(Protein anchor，PA)實(shí)現(xiàn)裝載抗原蛋白，可用于多種(細(xì)菌、寄生蟲、病毒)抗原遞送［1-3］。該系統(tǒng)由食品級遺傳元件組成，生物安全性好，此外，不需要抗原純化，可極大降低制造成本，現(xiàn)已成為生物制品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

肽聚糖錨鉤蛋白PA來自乳酸乳球菌主要自溶素AcmA的C-端［4］。AcmA是乳酸乳球菌的一種主要肽聚糖水解酶，主要與細(xì)胞分離和穩(wěn)定期細(xì)胞消融有關(guān)，參與細(xì)胞分裂和穩(wěn)定期時的菌體自溶過程［5］。AcmA一般由1個具有催化活性的N-末端結(jié)構(gòu)域和1個具細(xì)胞壁錨定活性的C-末端結(jié)構(gòu)域(cA結(jié)構(gòu)域)組成。天然的cA結(jié)構(gòu)域包含3個被異源性序列間隔開的LysM(Lysin motif)，每個LysM由45個氨基酸殘基組成，且高度同源，也被稱為重復(fù)序列(Repeats)。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌AcmA突變菌株中2個LysM同樣具有錨定活性［6］。

目前，肽聚糖錨鉤蛋白PA大腸桿菌原核表達(dá)相關(guān)研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬以錨鉤蛋白PA為研究對象，分別設(shè)計(jì)2個與3個LysMs，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到乳酸乳球菌LysMs基因片段;然后構(gòu)建pET-32a(+)-2(3)LysMs原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最后進(jìn)行融合蛋白的純化及錨定活性鑒定。為今后該蛋白多克隆抗體制備及與目的抗原的融合表達(dá)等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體 乳酸乳球菌MG1363，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;大腸桿菌工程菌DH5α、BL21(DE3)均為國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存，pET32a(+)原核表達(dá)載體也為該實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物與d(T)引物;限制性內(nèi)切酶 Xho I、EcoR I及其反應(yīng)緩沖液;PCR反應(yīng)所需的Ex Taq酶、R Taq酶、dNTP、Ex Taq buffer、PCR buffer、鎂 離 子;pMD18-T載體，T載體連接Buffer;DNA連接酶，DNA連接Buffer;Mini BEST膠回收試劑盒;瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE凝膠電泳Marker與buffer均購自大連TaKaRa公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。GM17培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 LysMs基因的擴(kuò)增 提取乳酸乳球菌MG1363細(xì)菌總RNA，然后應(yīng)用隨機(jī)引物與d(T)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增獲取目的基因。

引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中乳酸乳球菌MG1363的AcmA及質(zhì)粒pET32a(+)的載體序列，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計(jì)引物如下，2LysMs序列上游引物:5'-CCGGAATTCACTACTTATACCGTCAA ATC-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGCTATGAAACAATAAGATTTTGA-3'。3LysMs序列上游引物:5'-CCGGAATTCACTACTTATACCGTCAAATC-3';下游引物:5'-CCGCTCGAGTTATTTTATTCGTAGA TACTGAC-3'(下劃線為限制性酶切位點(diǎn))。

以上擴(kuò)增的目的基因上游引物加入的酶切位點(diǎn)均為EcoR I，下游引物加入的酶切位點(diǎn)均為Xho I。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，48℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.2 LysMs基因的克隆 參考分子克隆的方法將PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體以適當(dāng)比例混合，加入連接酶I(Solution I)于16℃反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含相應(yīng)抗生素(100 μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，用SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒［pMD18-T-2(3)LysMs］。經(jīng)Xho I和EcoR I限制性雙酶切鑒定，初步鑒定為陽性的克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)菌株的獲得 用Xho I和EcoR I分別雙酶切經(jīng)鑒定正確的pMD18-T-2(3)LysMs重組質(zhì)粒和 pET-32a(+)表達(dá)載體，回收目的基因和載體片段，加入 T4 DNA連接酶，16℃水浴連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-2LysMs與 pET-32a(+)-3LysMs，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含氨芐(100 μg/ml)的 LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，用SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確，即獲得陽性表達(dá)菌株。

1.2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs重組質(zhì)粒的BL21表達(dá)宿主菌，37℃培養(yǎng)過夜后，取此培養(yǎng)物按1%體積比接種于加入氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 h，OD600為0.5時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 各取 1 ml菌液;同時用未插入目的基因的pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，獲得空載體對照菌。將取樣菌液處理后，12%SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 融合蛋白表達(dá)形式鑒定 取方法1.2.4中確定最佳誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌10 ml，離心收集菌體，將1/10菌液體積的PBS重懸沉淀，冰浴下超聲波破碎菌體，離心收集上清和沉淀，經(jīng)12%SDS-PAGE分析，觀察蛋白質(zhì)的分布情況。

1.2.6 融合蛋白的純化與復(fù)性 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要出現(xiàn)于沉淀部分，提示目的蛋白以不溶性包涵體形式存在。沉淀加入洗滌液Ⅰ(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton-100)室溫作用20 min，12 000 r/min離心 10 min，棄上清，再加入洗滌液Ⅱ(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，3 mol/L尿素，0.5%Triton-100)室溫作用20 min，12 000 r/min離心10 min。洗滌后的包涵體用變性液(1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，6 mol/L鹽酸胍，5%甘油，5 mmol/L DTT)溶解，12 000 r/min離心10 min取上清。

融合蛋白的復(fù)性采用透析復(fù)性法。以變性液稀釋上清，使蛋白質(zhì)終濃度≤100 μg/ml，將稀釋液轉(zhuǎn)移到透析袋中，依次在含有 4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0 mol/L鹽酸胍的復(fù)性緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl，500mmol/L NaCl，1mmol/L GSH，0.1 mmol/L GSSG，pH 8.0)中透析復(fù)性24 h，并加入0.5 mol/L L-精氨酸。最后在PBS緩沖液中透析2次，每次4 h。經(jīng)聚乙二醇(PEG20000)濃縮至適當(dāng)體積，4℃、12 000 r/min離心10 min后，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.7 GEM顆粒的制備 乳酸乳球菌MG1363在新鮮GM17培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過夜，6 000 r/min下離心5 min，收集菌體，滅菌純水洗滌1次，然后用1/5體積0.1 mol/L的HCl重懸，煮沸30 min，PBS洗滌 3次，計(jì)數(shù)，以 2.5×109為 1 U，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 融合蛋白與GEM顆粒的結(jié)合及鑒定 將500 μl(1 mg/ml)復(fù)性的目的蛋白與1 U GEM顆粒室溫孵育30 min，6 000 r/min下離心5 min，收集沉淀。PBS洗滌3次，經(jīng)Western-blot鑒定其結(jié)合效果。Western-blot試驗(yàn)步驟:取收集的沉淀用適量PBS重懸后12%SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂乳室溫封閉1 h，加鼠His單克隆抗體(1∶10 000)，4℃過夜;TBST洗膜3次，每次10 min，再加HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)，膜室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后應(yīng)用DAB顯示蛋白質(zhì)條帶。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增

GM1363菌體總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得2LysMs特異性條帶，大小為363 bp(圖1A);獲得3LysMs特異性條帶，大小為585 bp(圖1B)?；厥掌谓?jīng)公司測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，序列結(jié)果完全一致。

圖1 LysMs基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the LysMs gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs經(jīng)Xho I和EcoR I分別限制性雙酶切，結(jié)果如圖2所示，其中約5 900 bp為酶切載體大小，363 bp與585 bp為DNA目的片段大小。

圖2 pET32a(+)-LysMs陽性質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identifications of recombinant plasmid pET32a(+)-LysMs by enzyme digestion

2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

如圖3所示，含有 pET-32a(+)-2LysMs、pET-32a(+)-3LysMs與 pET-32a(+)的 BL21菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分析，誘導(dǎo)的pET-32a(+)菌體有一處不同于未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)菌的特異性條帶，即載體蛋白質(zhì)的大小約為20 000。含有pET-32a(+)-2LysMs的菌體表達(dá)32 000大小的特異性條帶，即肽聚糖錨鉤融合蛋白。表明含有2個LysMs的肽聚糖錨鉤蛋白相對分子量約為12 000。從IPTG不同誘導(dǎo)時間發(fā)現(xiàn)，pET-32a(+)-2LysMs菌體表達(dá)的融合蛋白表達(dá)量在1～2 h達(dá)到最大值，之后目的蛋白量逐漸減少。含有pET-32a(+)-3LysMs的菌體經(jīng)同樣方法誘導(dǎo)后未見融合蛋白表達(dá)。本試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果一致。

圖3 重組pET-32a(+)-2LysMs表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE of recombinant pET-32a(+)-2LysMs expressed in E.coli

2.4 融合蛋白表達(dá)形式

將含有pET-32a(+)-2LysMs菌體IPTG誘導(dǎo)后收集菌體超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，SDSPAGE分析，可見沉淀中有明顯的融合蛋白特異性條帶，而上清中無特異性條帶(圖4)，表明融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。

圖4 pET-32a(+)-2LysMs原核表達(dá)產(chǎn)物的分布Fig.4 Prokaryotically expressed protein of pET-32a(+)-2LysMs in E.coli

2.5 融合蛋白的復(fù)性及錨定活性鑒定

融合蛋白經(jīng)鹽酸胍復(fù)性，12%SDS-PAGE分析得到較純的PA融合蛋白(圖5)。經(jīng)Western blot鑒定，復(fù)性后的PA融合蛋白可與GEM顆粒結(jié)合，表明該蛋白質(zhì)具有良好的錨定活性(圖6)。

圖5 pET-32a(+)-2LysMs原核表達(dá)產(chǎn)物的純化Fig.5 Purification of prokaryotically expressed protein of pET-32a(+)-2LysMs in E.coli

圖6 融合蛋白與GEM顆粒結(jié)合Western blot鑒定Fig.6 The anchoring between the fusion protein and GEM(gram-positive enhancer matrix)identified by Western blot

3 討論

目前，已報(bào)道的用于表達(dá)PA融合蛋白的宿主菌只有乳酸乳球菌一種［3，6-8］。肽聚糖錨鉤蛋白PA來自乳酸乳球菌自溶素AcmA的C-端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的3個LysMs序列重復(fù)單元之間的間隔序列，是由豐富的絲氨酸、蘇氨酸與天冬氨酸組成［9］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳酸菌細(xì)胞中的蛋白酶HtrA可以對這些間隔氨基酸進(jìn)行剪切從而降解AcmA的C-端結(jié)構(gòu)域。此外，AcmA缺失乳球菌可使細(xì)菌形成長鏈，增加宿主菌PA的表達(dá)量［3］。因此，國外構(gòu)建的表達(dá)PA宿主菌大都為HtrA與AcmA雙缺失的乳酸乳球菌［3，6-8］。應(yīng)用自身宿主菌表達(dá) PA蛋白可確保PA具有更高的錨定活性。然而，由于乳酸乳球菌屬于革蘭氏陽性菌，外源基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)較難，其次蛋白表達(dá)產(chǎn)量也較低。因此，基因操作技術(shù)更為成熟的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能否表達(dá)PA融合蛋白，成為本試驗(yàn)提出的新命題。

本試驗(yàn)中分別構(gòu)建了pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs原核表達(dá)載體，但研究發(fā)現(xiàn)僅有pET-32a(+)-2LysMs表達(dá)載體在表達(dá)宿主菌BL-21大腸桿菌中得到表達(dá)，而pET-32a(+)-3LysMs重組質(zhì)粒宿主菌經(jīng)各種條件優(yōu)化誘導(dǎo)，也未能表達(dá)目的蛋白。乳酸乳球菌HtrA缺失株作為宿主菌，可以防止宿主HtrA對PA的剪切，確保正常分泌;而大腸桿菌體內(nèi)可能存在HtrA相似的酶類，可剪切間隔序列中的氨基酸，致使3個LysMs重復(fù)結(jié)構(gòu)域的目的蛋白被降解而得不到表達(dá)。此外，通常原核表達(dá)形成包涵體形式的目的蛋白，在5 h內(nèi)表達(dá)量都很高。而本試驗(yàn)中pET-32a(+)-2LysMs重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌誘導(dǎo)后，目的蛋白的表達(dá)量在1～2 h時最多，之后逐漸減少，這是否與間隔序列被逐漸破壞，目的蛋白不斷被降解有關(guān)尚未可知。2個LysMs重復(fù)序列表達(dá)出的目的蛋白肽鏈較短，比3個LysMs序列少了一個間隔序列，為什么該目的蛋白沒有被完全降解?這些問題都有待進(jìn)一步研究。

對融合蛋白的表達(dá)形式分析后，結(jié)果表明，所表達(dá)的PA融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。經(jīng)變性復(fù)性后的PA蛋白可與GEM顆粒相結(jié)合，表明大腸桿菌原核表達(dá)獲得的PA融合蛋白同樣具有肽聚糖錨定活性。包涵體形式便于表達(dá)產(chǎn)物的純化，本研究也獲得了較純的PA融合蛋白。包涵體的缺點(diǎn)是需要超聲破碎菌體，再經(jīng)裂解、洗滌、變性、復(fù)性等復(fù)雜處理才可得到可溶性蛋白［10-11］。

本研究成功構(gòu)建了 pET-32a(+)-2LysMs與pET-32a(+)-3LysMs原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)大腸桿菌獲得了較純的含有2個LysMs的、具有良好錨定活性的PA融合蛋白質(zhì)，為今后PA蛋白多克隆抗體制備及與目的抗原的融合表達(dá)等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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