張 俊， 錢 勇， 鐘 聲， 孟春花， 王慧利， 李隱俠， 曹少先

(1.江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農業(yè)科學院動物品種改良和繁育重點實驗室，江蘇 南京210014)

黑素皮質素受體4(Melanocortin receptor-4，MC4R)是下丘腦腹內側核分泌的一種肽類物質［1］，單一外顯子編碼，為G蛋白質耦聯受體超家族成員之一。研究結果表明，MC4R基因的突變與人和動物的生長、采食量、能量穩(wěn)態(tài)和脂肪沉積等性狀顯著相關［2-5］，可作為選擇動物生長性狀的遺傳標記。張菊等成功克隆了綿羊MC4R基因的cDNA序列［6］;張子軍等克隆了安徽白山羊MC4R基因的編碼區(qū)和部分 5'、3'非編碼區(qū)序列［7］，但關于山羊 MC4R 基因多態(tài)性及其與生產性狀關聯的研究尚未見報道。為此，本研究對波爾山羊MC4R基因進行了克隆和測序，尋找波爾山羊MC4R基因的多態(tài)性位點，分析其多態(tài)性與波爾山羊體重的關聯，為山羊生長性狀的分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

164只波爾山羊樣本由江蘇省農業(yè)科學院六合動物實驗基地統一飼養(yǎng)管理，營養(yǎng)以及管理水平保持一致。波爾山羊各月齡的體重資料均由江蘇省農業(yè)科學院六合動物實驗基地提供。每個個體采集耳組織樣，置冰桶中帶回實驗室，－20℃保存。

1.2 組織DNA提取

組織DNA提取采用酚-氯仿抽提法，TE Buffer溶解后－20℃保存。

1.3 MC4R 基因擴增

根據GenBank:EU622853.2設計引物。上游引物序列:5'-TCCAAGTGATGCCGACCAG-3'，下游引物序列:5'-CTGGGCACTGCTTCACATC-3'。PCR反應總體系 20.0 μl，含模板 DNA 60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 ×緩沖液 2.0 μl，添加滅菌雙蒸水至 20.0 μl。PCR 反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.4 克隆與測序

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機選取10只波爾山羊的PCR產物用TaKaRa膠回收試劑盒回收后與PMD-19T載體連接，16℃培養(yǎng)過夜，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)16 h，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.5 突變位點篩選

將11個陽性克隆的測序結果與GenBank序列對比，確定突變位點。

1.6 PCR-RFLP 分析

1.6.1 目的基因擴增 根據測序結果選擇MC4R C端基因片段2個突變位點(分別位于Ban II、Xsp I識別序列內)，設計2對引物(P1和P2)分別擴增MC4R基因Ban II位點序列和Xsp I位點序列，引物序列見表1。

各引物 PCR 反應總體系為 20.0 μl，含模板DNA60 ng，Taq 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，dNTP(10 mmol/L)0.4 μl，引物(10 μmol/L)各 0.6 μl，MgC12(25 mmol/L)1.2 μl，10 × 緩沖液 2.0 μl，添加滅菌雙蒸水至20.0 μl。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72℃延伸時間分別為15 s、8 s，35個循環(huán)。PCR產物分別經1.5%、2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色檢測擴增結果。

表1 波爾山羊MC4R基因PCR-RFLP分析選用的引物Table 1 The primers for PCR-RFLP analysis of MC4R gene in Boer goats

1.6.2 基因型的確定 采用限制性內切酶Ban II、Xsp I分別對PCR擴增產物進行酶切。酶切反應體系 16.0 μl，含 PCR 產物 4.0 μl、Ban II和 Xsp I(10 U/μl)各 0.5 μl、10 × 緩沖液 1.0 μl、滅菌雙蒸水10.5 μl。37℃酶切3 h。均用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，EB染色，培清JS-780全自動凝膠成像分析儀進行成像分析。

1.7 數據分析

對不同基因型的體質量采用SPSS軟件中的One-Way ANOVA進行方差分析。

2 結果

2.1 MC4R基因片段的擴增結果

10只波爾山羊DNA模板分別進行MC4R基因片段PCR擴增，在1 400 bp左右得到一條特異性條帶(圖1)。

圖1 波爾山羊MC4R基因片段的擴增結果Fig.1 PCR amplification of MC4R gene in Boer goats

2.2 多態(tài)性位點的篩選

將10只波爾山羊DNA模板擴增得到的MC4R基因片段克隆后進行測序，測序結果與GenBank序列比對后發(fā)現MC4R C端基因片段存在2個點突變(圖2)，分別為編碼區(qū)946 bp處A與C單堿基顛換，986 bp處C與T單堿基顛換。經分析A946C位點處于Ban II酶切位點內，C986T位點處于Xsp I酶切位點內。

圖2 波爾山羊MC4R基因突變位點測序結果Fig.2 The sequencing results of mutation loci of MC4R gene in Boer goats

2.3 PCR-RFLP檢測方法的建立

對164只波爾山羊樣本進行PCR擴增，2對引物都獲得了特異性良好的產物(圖3)，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度與預期結果一致。分別采用相應的限制性內切酶對2種PCR產物進行消化，A946C位點經Ban II消化出現2種基因型:AA(228 bp)、AC(59 bp、169 bp 和 228 bp)(圖4);C986T位點經Xsp I消化出現3種基因型:CC(22 bp、130 bp)、CT(22 bp、130 bp 和 152 bp)、TT(152 bp)(圖 5)。

圖3 波爾山羊MC4R基因片段PCR擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis patterns of MC4R gene fragment in Boer goats by PCR

圖4 波爾山羊MC4R基因片段Ban II酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Ban II

圖5 波爾山羊MC4R基因片段Xsp I酶切電泳圖Fig.5 Electrophoresis patterns of Boer goats MC4R gene digested with Xsp I

2.4 MC4R基因多態(tài)位點的群體遺傳學特性

由表2可見，A946C位點只檢測出2種基因型，C986T位點檢測出3種基因型。A946C位點AA型居多，占79.3%;AC型較少，占20.7%;A為優(yōu)勢基因。C986T位點CC型居多，占95.7%;CT型和TT型較少，分別占3.7%和0.6%;C為優(yōu)勢基因。A946C和C986T位點在波爾山羊群體中均表現為低度多態(tài)(PIC＜0.25)，而且群體遺傳雜合度較低，表明2個多態(tài)位點在波爾山羊群體中的遺傳一致性較高。

表2 A946C和C986T位點的基因型和基因頻率在波爾山羊群體中的分布Table 2 Distribution of gene and genotype frequency of loci A946C and C986T in Boer goats

2.5 不同基因型對波爾山羊體質量的影響

MC4R基因A946C和C986T位點與波爾山羊體質量的相關性分析見表3。結果顯示:在受檢的波爾山羊群體中，A946C位點2種基因型間各月齡波爾山羊體質量差異均不顯著。C986T位點CT基因型個體的六月齡質量和六月齡日增質量均極顯著高于CC基因型，且CT基因型個體的周歲質量和周歲日增質量均顯著高于CC基因型，其他月齡體質量和日增質量差異均不顯著;TT基因型因只有一個個體，無法進行差異顯著性分析，但TT型各月齡體質量和日增質量均高于其他基因型。

表3 MC4R基因A946C和A986C位點不同基因型的波爾山羊體質量Table 3 Body weights of Boer goats in different genotypes of MC4R gene at loci A946C and A986C

同行同位點不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平，同行同位點不同大寫字母表示差異達0.01極顯著水平。

3 討論

大量研究結果表明MC4R基因在動物采食和能量平衡調控中起關鍵作用。MC4R基因敲除的小鼠表現出多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀［3］，人MC4R基因突變可導致遺傳性肥胖。豬MC4R基因的Asp298Asn突變與豬的背膘厚、生長速度和采食量顯著相關［8］，兔 MC4R基因237 bp處 A/G突變顯著影響兔體質量、全凈膛質量以及飼料轉化率［9］。雞MC4R基因5'調控區(qū)和編碼區(qū)上的4個突變位點對雞的體質量、屠體性狀有顯著影響［10］。肉牛MC4R基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與其生長性狀和脂肪沉積顯著相關［11-13］。中國美利奴羊MC4R基因3'側翼區(qū)的3個突變位點對其體斜長和腰角寬有顯著影響［14］。但山羊MC4R基因多態(tài)性及其與生產性狀關聯分析尚未見報道。

通過克隆測序，我們發(fā)現波爾山羊MC4R基因編碼區(qū)存在多個 SNPs，其中位于編碼區(qū)末端的A946C和C986T位點分別導致I變成L(異亮氨酸→亮氨酸)和S變成F(絲氨酸→苯丙氨酸)。C端是MC4R錨定在質膜所必須的，該段序列的缺失或者突變可能引起MC4R蛋白質無法錨定到質膜，從而使其無法與配體結合，導致功能缺失［15］。本試驗通過PCR-RFLP方法檢測了A946C和C986T位點在波爾山羊中的多態(tài)性。結果發(fā)現A946C位點檢測出2種基因型，C986T位點檢測出3種基因型。A946C位點AA型居多，AC型較少，A為優(yōu)勢基因。C986T位點CC型居多，CT型較少，TT型只檢測到1個樣本，C為優(yōu)勢基因。

本研究還分析了A946C和C986T位點不同基因型與波爾山羊群體各月齡體質量的關聯性。結果表明，波爾山羊A946C位點2種基因型間各月齡體質量差異均不顯著。C986T位點CT基因型個體的六月齡質量和六月齡日增質量均極顯著高于CC基因型，且CT基因型個體的周歲質量和周歲日增質量均顯著高于CC基因型，其他月齡體質量和日增質量差異不顯著;TT基因型各月齡體質量和日增質量均高于其他基因型，但TT基因型只有一個樣本，無法進行差異顯著性分析。推測在C986T位點中，T基因對山羊體質量的增加更有利。綜上所述，MC4R基因C986T位點可以作為山羊體質量性狀標記輔助選擇的候選分子標記。

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