錫林高娃， 任洪寶， 曹貴方

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028400;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028400;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

病原微生物最初在動(dòng)物機(jī)體上皮、黏膜表面增殖、入侵，由于病原特異性免疫反應(yīng)相對(duì)滯后，機(jī)體必須在上皮表面對(duì)微生物進(jìn)行有效殺滅，即產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)，以防止病原微生物的過量增殖造成更大危害。由于雌性動(dòng)物生殖道的生理功能，必須運(yùn)行有效的黏膜屏障使得精子通過，同時(shí)阻止有害微生物進(jìn)入子宮及輸卵管，所以非特異性免疫對(duì)于雌性生殖道至關(guān)重要。β－防御素作為來自機(jī)體自身的內(nèi)源性抗菌肽，廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，參與生物體非特異性免疫反應(yīng)，具有較強(qiáng)的廣譜殺菌功能［1-2］。為闡明蒙古綿羊β-防御素(Sheep beta-defensin，sBD-1)在輸卵管組織內(nèi)的表達(dá)定位，本研究擬以擴(kuò)增的sBD-1 cDNA作為探針，采用RNA原位雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，旨在為進(jìn)一步研究sBD-1在蒙古綿羊生殖系統(tǒng)非特異性免疫防御機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及其組織

5只健康狀況良好的成年蒙古綿羊由呼和浩特市回民屠宰場(chǎng)提供。取輸卵管組織固定，HE染色，在含0.1%DEPC的4%多聚甲醛中固定4 h，然后于無RNA酶條件下進(jìn)行石蠟包埋。其余迅速取樣后液氮凍存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒(Cat.NO.Z5110)購(gòu)自Promega公司;RT-PCR 試劑盒(Cat.NO.DRR019A)購(gòu)自大連寶生物工程公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Cat.NO.DP208/209)購(gòu)自南京博爾迪公司;地高辛探針標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Cat.NO.11745832910)購(gòu)自 Roche 公司;DEPC、EDTA、Tris-HCl、吐溫20、硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、去離子甲酰胺、鮭魚精DNA、多聚賴氨酸、蛋白酶K、雜交專用蓋玻片、尼龍膜等購(gòu)自Sigma公司;融蠟箱、恒溫箱、切片機(jī)及馬來酸等常規(guī)試劑為本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法

1.3.1 sBD-1核酸探針的合成 根據(jù)羊 β-防御素cDNA序列(GenBank登錄號(hào):U75250)設(shè)計(jì)引物(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為300 bp左右)P1(5'-GCCAACATGAGGCTCCATCACCTGCTCCT-3')和P2(5'-AACTTTGAACAAAATTTATTCTGGTTTAAATT-3')。提取輸卵管組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR擴(kuò)增并回收測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增序列的真實(shí)性。對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行地高辛標(biāo)記，并根據(jù)地高辛標(biāo)記產(chǎn)物達(dá)到預(yù)期效率的測(cè)定方法對(duì)本標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。對(duì)比Control DNA(試劑盒提供)和地高辛標(biāo)記產(chǎn)物形成的斑點(diǎn)，如果稀釋為0.1 pg的斑點(diǎn)即第5個(gè)斑點(diǎn)可見，那么地高辛標(biāo)記產(chǎn)物達(dá)到了預(yù)期的效率，可做雜交。

1.3.2 切片制備和雜交 將固定好的輸卵管組織切片，貼于用多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上，60℃干烤1 h。烘烤后的切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精下行至無RNase水，空氣干燥約10 min;切片浸入含50 μg/ml蛋白酶K的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中，37℃ 消化6～7 min;PBS洗2次，4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS中固定1.5 min;PBS洗2次，干燥。每張切片滴加30 μl預(yù)雜交液(5×SSC，5×Denhardt，50%去離子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鮭魚精DNA)，42 ℃預(yù)雜交1 h;輕輕傾去預(yù)雜交液，每張切片再滴加20 μl雜交液(5×SSC，5 ×Denhardt，50% 去離子甲酰胺，1%SDS，250 μg/ml鮭魚精DNA，10%硫酸葡聚糖，1 μl雜交液中加入3 ng sBD-1 cDNA反義探針)，蓋上雜交專用蓋玻片，42℃雜交20 h。2×SSC中振蕩去掉蓋玻片，切片順次經(jīng)2×SSC、1×SSC、0.25×SSC中室溫各2×15 min;每張切片滴加30 μl封閉液，于濕盒內(nèi)室溫下作用30 min;輕輕傾去封閉液，每張切片滴加30 μl 1∶5 000抗地高辛AP液(Anti-DIG-AP)，濕盒內(nèi)室溫2 h;切片在馬來酸緩沖液(0.1 mol/L馬來酸，0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)中室溫2×15 min，在顯色緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，pH 9.5)中室溫10 min;每張切片滴加30 μl 1∶50的NBT/BCIP顯色液，濕盒內(nèi)避光顯色6 h;滅菌水終止顯色反應(yīng)，伊紅復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，鏡下觀察，照相。陰性對(duì)照試驗(yàn):雜交液中不加探針，其余步驟同上。

2 結(jié)果

將RT-PCR產(chǎn)物回收經(jīng)電泳檢測(cè)，條帶單一，大小為301 bp，且cDNA含量為5 ng/μl，可用于探針制備。產(chǎn)物經(jīng)地高辛標(biāo)記，0.1 pg斑點(diǎn)已經(jīng)顯藍(lán)色，說明標(biāo)記的探針已達(dá)到預(yù)期量1 000 ng，可做雜交試驗(yàn)。

檢測(cè)蒙古綿羊輸卵管組織中sBD-1 mRNA在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，應(yīng)用sBD-1 cDNA地高辛標(biāo)記的探針雜交，在輸卵管上皮近管腔的游離面胞質(zhì)內(nèi)有非常強(qiáng)的藍(lán)紫色的雜交信號(hào)(圖1A和圖1B)，而陰性對(duì)照無雜交信號(hào)(圖1C和圖1D)。如圖1所示，sBD-1 mRNA的雜交信號(hào)主要位于輸卵管黏膜層上皮細(xì)胞胞質(zhì)的游離端內(nèi);肌層、外膜、固有層內(nèi)均無雜交信號(hào)。這說明輸卵管黏膜層上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)是表達(dá)sBD-1 mRNA的場(chǎng)所，而固有層、肌層、結(jié)締組織等均不表達(dá)。

圖1 蒙古綿羊輸卵管上皮細(xì)胞原位雜交結(jié)果Fig.1 The expression of β-defensin in fallopiantube of Mongolian sheep by in situ hybridization

3 討論

β-防御素作為一類大量存在于哺乳動(dòng)物上皮組織內(nèi)的內(nèi)源性抗微生物肽，參與生物體天然免疫和獲得性免疫，具有較強(qiáng)的廣譜殺菌功能，且迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)病原菌對(duì)它產(chǎn)生耐藥性。鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)于反芻動(dòng)物雌性生殖道β-防御素研究比較缺乏，本研究檢測(cè)其在輸卵管組織內(nèi)的表達(dá)定位，對(duì)于了解反芻動(dòng)物妊娠期間防御素表達(dá)調(diào)控的基本規(guī)律及在機(jī)體防御功能方面的作用均具有重大意義。

起初，哺乳動(dòng)物防御素被認(rèn)為是只存在于造血細(xì)胞起源的細(xì)胞內(nèi)，后來相繼在人和鼠的小腸潘氏細(xì)胞內(nèi)、牛舌和豬舌、腸道和氣管的黏膜上皮內(nèi)發(fā)現(xiàn)有防御素mRNA的表達(dá)［3-5］。對(duì)于綿羊雌性生殖道內(nèi)的β-防御素(sBD-1)，目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道。雌性生殖系統(tǒng)內(nèi)的防御素的研究目前主要集中在人防御素(hBD1-3)及鼠防御素(rBD-1，rBD-2)上。Pivarcsi等研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人陰道上皮細(xì)胞能夠分泌對(duì)抗病原菌感染的hBD-2［6］。Valore等通過原位雜交定位，HBD-1 mRNA在腎臟Henle環(huán)、遠(yuǎn)端小管、收集管的上皮層內(nèi)表達(dá)，在雌性生殖道的輸卵管、子宮、子宮頸、陰道的上皮層表達(dá)，并對(duì)大腸埃希菌等微生物均有殺滅作用，提出HBD-1是女性泌尿生殖道重要的先天免疫防御因子，對(duì)泌尿生殖道局部抗菌防御起重要作用［7］。King等通過RT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，人子宮內(nèi)膜作為先天免疫的重要場(chǎng)所，分泌hBD1-4、WAP蛋白對(duì)抗外源菌的侵襲從而保護(hù)機(jī)體［8］。通過RTPCR技術(shù)檢測(cè)到，鼠β-防御素存在于雌性生殖道的上皮細(xì)胞內(nèi)，并且起抗菌作用。陳新年等證實(shí)大鼠β－防御素基因(rBD-1，rBD-2)在皮膚、腎臟、肺臟、子宮頸等均有表達(dá)［9］。本試驗(yàn)通過原位雜交方法定位研究，發(fā)現(xiàn)在蒙古綿羊輸卵管黏膜層的上皮細(xì)胞游離面的胞質(zhì)內(nèi)存在sBD-1表達(dá)，符合β-防御素主要表達(dá)于黏膜表面細(xì)胞的一般規(guī)律。

［1］BOMAN H G.Peptide antibiotics and their role in innate immunity［J］.Annu Rev Immunol Annu Rev Immunol，1995，13:61-92.

［2］GANZ T，LEHRER R I.Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia［J］.Semin Hematol，1997，34:343-354.

［3］THOUZEAU C，MAHO Y L，F(xiàn)ROGET G，et al.Spheniscins:avian β-defensins in preserved stomach contents of the king penguin，Aptenodytes patagonicus［J］.Biol Chem，2003，278:51053-51058.

［4］ANNE E K，HILARY O D C，RODNEY W K.Innate immune defences in the human endometrium ［J］.Reprod Biol Endocrinol，2003，1:116.

［5］WIESENFELD H C，HEINE R P，KROHN M A，et al.Association between elevated neutrophil defensin levels and endometritis［J］.Infect Dis，2002，186(6):792-797.

［6］PIVARCSI A，NAGY I，KORECK A，et al.Microbial compounds induce the expression of pro－inflammatory cytokines，chemokines and human beta-defensin-2 in vaginal epithelial cells［J］.Microbes Infect，2005，7(9-10):1117-1127.

［7］VALORE E V，PARK C H，QUAYLE A J，et al.Human beta-defensin-1:an antimicrobial peptide of urogenital tissues［J］.J Clin Invest，1998，101:1633-1642.

［8］KING A E，F(xiàn)LEMING D C，CRITCHLEY H O，et al.Differential expression of the natural antimicrobials，beta-defensins 3 and 4，in human endometrium［J］.Reprod Immunol，2003，59(1):1-16.

［9］陳新年.大鼠-防御素-1基因在大鼠皮膚和腎臟固有表達(dá)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2001，17(1):13-15.