張 帆，劉守江，魏 巍，張國(guó)良，陳心春，周伯平，王 健

(1.深圳市南山區(qū)慢性病防治中心結(jié)核病防治科，廣東 深圳 518054；2.深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518112)

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入高度過(guò)敏狀態(tài)的機(jī)體胸膜腔而引起的胸膜炎癥，占結(jié)核性疾病的4%，我國(guó)胸腔積液患者中超過(guò)一半是有結(jié)核性胸膜炎引起。結(jié)核性胸膜積液如果未能及時(shí)診斷與治療，會(huì)造成胸膜肥厚粘連，限制性肺功能下降。結(jié)核性胸膜炎的診斷仍是目前臨床難題之一，缺乏有效、客觀、可靠的方法。近年來(lái)的研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在人體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，其是一類(lèi)高度保守的非編碼單鏈小RNA，近1/3的人類(lèi)基因表達(dá)受miRNA調(diào)控，涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個(gè)過(guò)程，miRNA表達(dá)異?？蓪?dǎo)致一些疾病的發(fā)生[1-2]。研究顯示，miRNA可能參與肺結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。本研究著重要進(jìn)一步探討miRNA在結(jié)核性胸膜炎患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6～11月在我院就診的結(jié)核性胸膜炎患者30例，年齡17～43歲，平均27歲，其中男性16例，女性14例；所有患者根據(jù)病史、體征、X線(xiàn)、超聲和胸腔積液檢查[3]診斷。無(wú)膿胸產(chǎn)生，無(wú)慢性肺病，無(wú)心、肝、腎等臟器合并癥及其他感染，無(wú)糖尿病、腫瘤等免疫相關(guān)性或免疫性疾?。痪鶗何唇邮苓^(guò)激素及免疫抑制劑、抗生素及抗結(jié)核治療。同時(shí)選取與病例組年齡、性別匹配的30例健康者為對(duì)照組。本研究經(jīng)深圳市南山區(qū)慢性病防治院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本采集 采集兩組研究對(duì)象的外周血5 ml，肝素鋰抗凝，標(biāo)本采集后30 min內(nèi)，分裝200 μl全血于已預(yù)裝有Trizol和研磨珠的凍存管中，振蕩器振蕩混勻，-80℃保存。

1.2.2 miRNA提取 采用Invitrogen公司Trizol Reagent試劑盒抽提全血中總RNA，適量無(wú)RNase水充分溶解總RNA。采用核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性良好；調(diào)整RNA濃度，于-80℃保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄miRNA 取總RNA 1 μl，2×反轉(zhuǎn)錄緩沖混合物10 μl，RNase Free水5 μl，反轉(zhuǎn)錄酶2 μl，0.1%BSA 2μl。37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增方法參照熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)，分別取SYBR Green 12.5 μl，待測(cè)樣品 cDNA 2 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，水 8.5 μl，總體積25 μl。引物由invitrogen公司合成，引物序列：miR-365a-3p：5'-GCGCTAATGCCCCTAAAAATCCTT-3'；miR-29aL-3p：5'-CGTAGCACCAT CTGAAATCGGTT-3'；下游引物為通用引物；U6：TAKARA公司產(chǎn)品，Code：D356-03，Lot：B101B；。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 10 s；變性和延伸95℃ 5 s；60℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用熒光定量PCR中的相對(duì)定量法，以管家基因U6作為內(nèi)參，以2-△△Ct表示miRNA相對(duì)表達(dá)量，具體計(jì)算方法如下，待測(cè)miRNA的Ct值減去U6的Ct值，獲得各樣本中待測(cè)miRNA的△Ct值，然后采用實(shí)驗(yàn)組miRNA的△Ct值減去健康對(duì)照組的△Ct，獲得△△Ct，最后計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量 2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間外周血miR-365a-3p和miR-29a-3p的表達(dá)差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-365a-3p的表達(dá) 結(jié)核性胸膜炎組患者外周血miR-365a-3p表達(dá)(0.66±0.60)明顯高于健康對(duì)照組(0.33±0.29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 外周血miR-365a-3p在結(jié)核性胸膜炎患者和健康對(duì)照組中的表達(dá)

2.2 兩組外周血miR-29a-3p的表達(dá) 結(jié)核性胸膜炎組患者外周血miR-29a-3p表達(dá)(0.74±0.65)與健康對(duì)照組(0.75±0.31)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 外周血miR-29a-3p在結(jié)核性胸膜炎患者和健康對(duì)照組中的表達(dá)

3 討論

結(jié)核性胸膜炎發(fā)病率高，在肺外結(jié)核中僅次于淋巴結(jié)核，其確診主要依賴(lài)于痰、胸腔積液、胸膜活檢檢出結(jié)核桿菌或發(fā)現(xiàn)結(jié)核性肉芽腫，臨床上結(jié)核性胸膜炎常規(guī)檢查方法效率低，及時(shí)準(zhǔn)確地診斷結(jié)核性胸腔積液仍存在較多困難。隨著新研究新技術(shù)的迅速發(fā)展，生物學(xué)指標(biāo)在結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷中起到重要作用，特別是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA分子與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，miR-29a-3p表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Xu等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-365a可能在機(jī)體炎癥反應(yīng)中起到重要作用，miR-365a與細(xì)胞炎癥因子IL-6表達(dá)相關(guān)，miR-365a可通過(guò)直接與IL-6基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)IL-6 mRNA表達(dá)，從而抑制IL-6蛋白生成，miR-365a還可能通過(guò)非直接途徑抑制IL-6表達(dá)，而且其調(diào)控IL-6的能力超過(guò)let-7a。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達(dá)明顯升高，其可能參與了結(jié)核性胸膜炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

miR-29a除在抗纖維化中起到重要作用外，在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中也起到重要作用，miR-29a可通過(guò)靶向降解IFN-γ降低機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答，伊正君等[6]研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰液中miR-29a的表達(dá)相對(duì)于正常人明顯升高，可能在抗結(jié)核桿菌感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但在我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者外周血miR-29a的表達(dá)與正常人之間的差異，其可能與樣本量相對(duì)較少有關(guān)，具體還需進(jìn)一步分析。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者外周血miR-365a-3p表達(dá)明顯升高，其可能參與了結(jié)核性胸膜炎炎癥反應(yīng)的發(fā)生，具體作用仍待進(jìn)一步研究。同時(shí)，檢測(cè)外周血miR-365a-3p水平結(jié)合其他診斷方法，可能能提高結(jié)核性胸膜炎的診斷率。

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