卞洲艷，楊 政，徐 蔓，張潔鈺，廖海含，唐其柱

(武漢大學人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學心血管病研究所，湖北 武漢 430060)

實驗動物和人類疾病動物模型是生命科學、醫(yī)學、藥學等相關領域進行科學研究的重要支撐條件。大鼠是最重要的實驗動物之一，由于大鼠和人類的同源基因數(shù)更高，在解剖結構、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及藥物代謝等方面和小鼠相比與人類更接近，使大鼠成為心腦血管病、認知科學、分子影像學、器官移植及中醫(yī)藥學等領域進行研究更好的實驗動物[1]。隨著大鼠基因工程技術的建立，大鼠將成為生命科學和醫(yī)藥研究的主要模型。

目前主要發(fā)展的基因修飾技術包括：慢病毒載體技術、PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、鋅指核酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)以及最新發(fā)展的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術。TALEN 由 TALE(Transcription activator-like effector)結構域和Fok I核酸內(nèi)切酶結構域人工融合而成，能夠特異性的識別目的DNA序列，并通過Fok I核酸內(nèi)切酶形成二聚體對雙鏈DNA進行切割，斷裂的DNA可以啟動修復功能，從而實現(xiàn)靶位點的基因敲除、敲入及基因修復等[2]。相對上述其他基因修飾技術，TALEN技術因其可對基因組定點改造，且設計簡單、實驗周期短、打靶效率高等優(yōu)勢而被廣泛應用于植物、哺乳動物細胞、人類細胞、斑馬魚、果蠅、爪蟾等物種。應用TALEN技術構建基因敲除大鼠也已逐漸開展，然而目前國內(nèi)外有關報道較少，應用該技術構建基因敲除大鼠時的TALEN質(zhì)粒注射濃度、注射后的陽性率等均有待進一步研究。本研究就TALEN技術構建基因敲除大鼠過程中超數(shù)排卵、顯微注射、胚胎移植以及出生率、陽性率等問題分別進行了探討，為廣泛有效地開展大鼠基因敲除提供了參考依據(jù)，為促進基因工程大鼠動物模型在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等研究中的應用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，8～10周齡雄性大鼠，用作種公鼠和結扎公鼠；4～6周齡雌性大鼠，用作超數(shù)排卵，8～10周齡雌性大鼠，用作受體。飼養(yǎng)條件為溫度(24±2)℃，濕度為(50±10)%，光照周期為6：00～18：00，12 h晝夜交替。

1.1.2 主要試劑 孕馬血清促性腺激素(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(hCG)，購自寧波市三生藥業(yè)有限公司，M2培養(yǎng)液(M7167，Sigma)，M16培養(yǎng)液(M7292，Sigma)，透明質(zhì)酸酶(H4272，Sigma)，礦物油(M8410，Sigma)，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)，PCR試劑盒(Takara)。

1.1.3 主要儀器耗材 體式顯微鏡(Olympus)，顯微注射系統(tǒng)，超凈工作臺，培養(yǎng)皿(BD Falcon)，一次性注射器，無菌手術器械(剪刀、鑷子、血管夾、持針器、手術縫線等)。

1.2 實驗方法

1.2.1 供體與受體準備 供體雌鼠超數(shù)排卵：選擇4～6周齡的雌鼠，于腹腔注射PMSG 20 IU/只，48 h后注射hCG 20 IU/只，按1：1的比例與成年雄鼠合籠，于次日早上觀察雌鼠陰栓，見栓雌鼠取卵用于顯微注射。雄鼠結扎：參考文獻方法[3]，選8～10周齡雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)麻醉后剪毛，75%酒精消毒，腹中線下方距陰莖2～3 cm處剪開皮膚肌肉，分別分離出兩側(cè)輸精管，將鑷子在酒精燈上加熱后燒斷輸精管，關閉腹腔，待恢復2周后用于和雌鼠交配準備受體。受體假孕鼠制備：于取卵前1 d選擇成年雌鼠與結扎雄鼠合籠，次日早上觀察雌鼠陰栓，見栓雌鼠即作為假孕鼠用作受精卵移植。

1.2.2 TALEN質(zhì)粒的準備 將構建的TALEN質(zhì)粒對分別取10μg酶切線性化，酚氯仿抽提、純化后取1μg作模板，按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明依次加入NTP/CAP、10×Buffer及Enzyme Mix，最后加水至20μl轉(zhuǎn)錄體系，于37℃水浴2 h。轉(zhuǎn)錄后純化、鑒定，分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.3 胚胎收集 將見栓雌鼠頸椎脫臼處死，75%酒精消毒后迅速剪開腹腔，分離卵巢輸卵管和子宮，剪下輸卵管置于37℃預熱的M2液滴中，在體式鏡下將輸卵管膨大部劃開，釋放出卵丘-卵母細胞復合體。透明質(zhì)酸酶消化去除顆粒細胞后，于M2培養(yǎng)液滴中洗3～5次后，移入覆蓋有礦物油的M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)以備顯微注射。

1.2.4 顯微注射 顯微鏡下觀察可見清晰原核的卵細胞為受精卵，挑選出用于顯微注射(圖1)。將TALEN質(zhì)粒對轉(zhuǎn)錄的mRNA中放入注射針虹吸，注射針尖端充滿液體后安裝于注射儀上，根據(jù)注射針的出液量多少調(diào)節(jié)注射壓力，注射后可見胞質(zhì)有明顯膨脹表明成功注射入胞質(zhì)。質(zhì)粒注射終濃度分別為 5 ng/μl、10 ng/μl、20 ng/μl和 30 ng/μl，共四組。將成功注射且存活的受精卵用于輸卵管移植。

圖1 顯微注射

1.2.5 輸卵管移植 將見栓的假孕鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg體重)，背部脊柱兩側(cè)肋骨下方剃毛，75%酒精消毒后依次剪開皮膚肌肉，可見白色脂肪體，用鑷子夾住脂肪體向外牽拉出卵巢、輸卵管、子宮，在體視鏡下找到輸卵管膨大部，用血管夾夾住脂肪體以固定輸卵管在鏡下合適的位置，在輸卵管膨大部前方避開血管走形剪開一小口，將移卵管插入開口吹入胚胎，液體后方吹入一氣泡防止液體反流。將脂肪體、卵巢、輸卵管及子宮還納入腹腔，縫合肌肉皮膚。

1.2.6 出生大鼠鑒定 將受精卵移植的假孕鼠單籠飼養(yǎng)22 d左右后觀察乳鼠出生情況。新生鼠生長至1周以上即剪腳趾，消化液55℃水浴消化過夜后，常規(guī)方法提基因組。對目的基因進行PCR擴增后送測序鑒定。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 超數(shù)排卵結果 購回的雌鼠分為4～5周和5～6周，兩組注射PMSG和hCG超數(shù)排卵，兩組雌鼠用相同的雄鼠交配，次日見栓率均在70%以上，從見栓雌鼠收集胚胎受精率均在80%以上，兩組的見栓率(P=0.820)、取卵數(shù)量(P=0.611)以及取卵的受精率(P=0.053)差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 不同周齡對SD大鼠超數(shù)排卵的影響(±s)

表1 不同周齡對SD大鼠超數(shù)排卵的影響(±s)

周齡(周)供體數(shù)量(只)超排見栓數(shù)量(只)見栓率(%)取卵數(shù)量(枚)受精率(%)4～5 5～6 60 76 44 57 0.74±0.09 0.77±0.06 25±2 23±2 0.85±0.02 0.93±0.02

2.2 受體準備 購買8～10周齡的公鼠結扎后作為結扎公鼠可在后續(xù)實驗循環(huán)使用。本研究觀察了不同周齡結扎公鼠和受體雌鼠合籠后的見栓情況(見表2)，發(fā)現(xiàn)結扎公鼠和受體雌鼠均在8～10周齡時，見栓率最高[(23.02±5.26)%]；隨著使用時間的增加，結扎公鼠11～13周齡時，見栓率開始下降[(17.06±2.24)%]，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.320)；當結扎公鼠使用到20～22周，受體雌鼠 16～18周時，見栓率明顯下降[(11.66±2.40)%]，與結扎公鼠和受體雌鼠均為8～10周齡組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.046＜0.05)。

表2 不同周齡結扎公鼠對受體見栓率的影響(±s)

表2 不同周齡結扎公鼠對受體見栓率的影響(±s)

注：a表示與結扎公鼠和受體雌鼠均為8～10周齡組比較，P＜0.05。

結扎公鼠周齡(周)見栓率(%)受體周齡(周)受體數(shù)量(只)8～10 11～13 20～22 23.02±5.26 17.06±2.24 11.66±2.40a 8～10 8～10 16～18 30 40 20

2.3 不同質(zhì)粒濃度對大鼠出生率和陽性率的影響 在本研究中將質(zhì)粒濃度分為四個組(5 ng/μl、10 ng/μl、20 ng/μl和 30 ng/μl)進行顯微注射，注射后輸卵管移植，每組濃度均移植100枚以上顯微注射后存活的受精卵。移植成功的大鼠在質(zhì)粒注射濃度為 5 ng/μl、10 ng/μl、20 ng/μl組的出生率分別為35.42%、42.21%、37.74%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.230，0.706)；而質(zhì)粒注射濃度為30 ng/μl組的出生率為18.95%，顯著低于質(zhì)粒注射濃度為5 ng/μl組(P=0.0014＜0.05)。出生的大鼠經(jīng)測序鑒定，陽性敲除大鼠從靶位點開始有明顯的套峰出現(xiàn)(圖2)。在5 ng/μl、10 ng/μl組未見目的基因敲除大鼠，在20 ng/μl、30 ng/μl組分別有3只和2只目的基因敲除的陽性大鼠，陽性率分別為7.5%、6.9%(表3)。該結果表明，質(zhì)粒注射濃度偏低時(5 ng/μl、10 ng/μl)，TALEN質(zhì)粒未能充分發(fā)揮敲除效力，但注射濃度偏高(30 ng/μl)時，顯著降低了大鼠的出生率。

表3 不同質(zhì)粒濃度對大鼠出生率和陽性率的影響

圖2 測序圖譜及序列比對

2.4 不同移植方式對大鼠出生率、存活率的影響 根據(jù)受體雌鼠見栓的情況，在當日超排受精卵數(shù)量較多而受體數(shù)量不足時，采取雙側(cè)移植(17～19枚/側(cè))和/或留作次日進行雙細胞移植。在本研究中，單側(cè)和雙側(cè)移植大鼠的出生率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.865)，但雙側(cè)移植出生大鼠的存活率明顯下降(P=0.021＜0.05)，見表4。顯微注射相同濃度質(zhì)粒的雙細胞較單細胞移植后大鼠的出生率顯著降低(P=0.028＜0.05，P=0.041＜0.05)，見表5。

表4 單側(cè)與雙側(cè)移植對大鼠出生率及存活率的影響

表5 單細胞與2細胞移植對大鼠出生率的影響

3 討論

隨著TALEN技術的興起和在各個領域的應用，運用TALEN技術構建基因敲除大鼠已成為目前高效、快捷地構建基因工程大鼠的方法之一，但由于該技術剛剛興起，尚有許多不成熟的地方。本研究就TALEN技術構建基因敲除大鼠中的超數(shù)排卵、顯微注射、胚胎移植以及移植后出生率、陽性率等具體問題逐一進行了初步探討，為優(yōu)化TALEN技術構建基因敲除大鼠奠定了基礎。研究發(fā)現(xiàn)，4～5周和5～6周的雌鼠超數(shù)排卵見栓率、取卵數(shù)量以及取卵的受精率差異均無統(tǒng)計學意義；結扎公鼠和受體雌鼠在8～10周齡時見栓率最高，隨著使用時間的增加，見栓率明顯下降；單側(cè)移植和單細胞移植有利于提高大鼠的出生率和存活率。在本研究中質(zhì)粒注射濃度在20 ng/μl時既不會影響大鼠出生率，又有較高的基因敲除陽性率。

超數(shù)排卵獲得大量優(yōu)質(zhì)胚胎是進行顯微注射的前提和基礎。超排的效果受動物的成熟度、品系和激素注射量和注射時間的影響。研究表明，隨著周齡的增加，動物內(nèi)源激素的表達，動物對外源激素的反應性降低[4-5]。因此，本研究中依據(jù)參考文獻[6]給予注射激素劑量20/20 IU，觀察不同周齡成熟度大鼠的超排效果。研究發(fā)現(xiàn)4～5周齡和5～6周齡的雌鼠超排見栓率均可達到70%以上，取卵的受精率均在80%以上，兩組之間見栓率、取卵數(shù)量以及取卵的受精率差異無統(tǒng)計學意義。因此選用4～6周齡的雌性SD大鼠均能達到較理想的超排效果。

受體雌鼠的見栓數(shù)量直接影響了移植胚胎的數(shù)量。而大鼠發(fā)情周期不同于小鼠，可以通過陰道口的變化來準確判斷其是否發(fā)情，因此提高大鼠的見栓率尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)隨著結扎公鼠周齡的增加以及使用頻率的增加，見栓率明顯下降。因此，結扎公鼠使用3個月以上時應根據(jù)合籠后的見栓情況淘汰更新結扎公鼠，以提高受體見栓率。在受體見栓率較低時，我們在研究中采取了雙側(cè)移植和/或次日進行2細胞移植的補救措施。雖然雙側(cè)移植不影響大鼠的出生率，但存活率顯著下降，這可能與雙側(cè)移植導致移植胚胎總數(shù)較多，使單個胚胎發(fā)育不良，出生后狀態(tài)較差有關。而顯微注射相同濃度質(zhì)粒，移植2細胞較單細胞大鼠的出生率顯著降低，這表明胚胎在體外的培養(yǎng)環(huán)境影響了胚胎生長發(fā)育，因此顯微注射后應盡快移植到大鼠體內(nèi)，不宜在體外放置太久。

TALEN質(zhì)粒濃度的高低是決定敲除效率的重要因素。在本研究中設置四個濃度組，發(fā)現(xiàn)低濃度組(5 ng/μl、10 ng/μl)的敲除效率為0，高濃度組(20 ng/μl、30 ng/μl)敲除效率可達到7%左右，但注射濃度偏高(30 ng/μl)時，顯著降低了大鼠的出生率。該結果與國外研究報道結論一致[7]，增加質(zhì)粒濃度過高時，不會增加質(zhì)粒的敲除效率，反而降低了大鼠的出生率。分析原因可能是質(zhì)粒濃度偏低，顯微注射過程中尚存在一定濃度的降解，注射到胚胎后，表達蛋白量更少，不足以發(fā)揮敲除功能；而高濃度的質(zhì)粒對胚胎具有一定的毒性作用，影響胚胎的生長發(fā)育。因此，選擇合適的質(zhì)粒濃度進行顯微注射，對于提高大鼠的出生率和陽性率尤為重要。在本研究中20 ng/μl的濃度既有較高的出生率，又可以達到一定的敲除效率。

綜上所述，本研究就應用TALEN技術構建基因敲除大鼠中的問題初步探討，建議選用4～6周齡雌性SD大鼠超排，定期更新淘汰結扎公鼠，選擇合適的顯微注射質(zhì)粒濃度，采取單側(cè)輸卵管早期單細胞移植的方式，以提高TALEN技術構建基因敲除大鼠的成功率和效率。本研究為有效的應用TALEN技術構建基因敲除大鼠提供了理論基礎和參考依據(jù)；由于本研究對該方法首次探索，還有未完善的地方，比如研究樣本數(shù)量雖足以進行統(tǒng)計學分析，但還沒有足夠大；通過該方法首次得到的是嵌合體大鼠，需進一步繁殖獲得純合子大鼠；尚只針對一種目的基因進行探討，而TALEN質(zhì)粒對不同基因不同外顯子的靶向敲除效率不盡相同等問題有待進一步研究解決。

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