馬強，常宗宏，王彪猛，王維，鄧尚新

自噬對大腸癌LoVo/Adr細胞多藥耐藥性的影響

馬強，常宗宏，王彪猛，王維，鄧尚新

目的探討大腸癌耐藥LoVo/Adr細胞自噬狀態(tài)對多藥耐藥(MDR)的影響。方法體外培養(yǎng)LoVo/Adr細胞，應用透射電鏡觀察細胞自噬體形成情況，采用MDC熒光染色及流式細胞術定量分析自噬率，MTT法測定細胞對阿霉素(ADR)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，RT-PCR檢測MDR1基因的mRNA水平，Western blotting檢測P糖蛋白(P-gp)表達水平。結果LoVo/Adr細胞中可見散在自噬體或點狀綠色熒光分布，自噬率為3.1%±0.5%；ADR和雷帕霉素(RAPA)單獨作用時，自噬體明顯增多，自噬率分別為33.6%±5.1%和45.2%±6.1%(P＜0.05)，ADR和RAPA聯(lián)合作用時可見大量自噬體形成，自噬率為76.2%±7.4%，顯著高于二者單獨作用時(P＜0.05)；LoVo/Adr細胞對ADR的IC50為3.05±0.52mg/L，RAPA作用后IC50降至1.12±0.21mg/L(P＜0.01)，RAPA具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍；LoVo/Adr細胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白呈高表達，在RAPA作用下，MDR1 mRNA表達量由1.42±0.31降至0.54±0.20(P＜0.05)，P-gp蛋白表達量由0.67±0.14降至0.15±0.08(P＜0.01)，RAPA顯著下調(diào)了MDR1 mRNA及蛋白的表達。結論多藥耐藥的LoVo/Adr細胞呈低自噬狀態(tài)，RAPA可通過提高細胞的自噬活性而逆轉(zhuǎn)MDR，逆轉(zhuǎn)途徑可能與促進細胞自噬性死亡和下調(diào)MDR1基因的表達有關。

自噬；多藥耐藥相關蛋白質(zhì)類；P糖蛋白；結直腸腫瘤

大腸癌是消化道常見腫瘤，術后化療引起多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導致腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后不良的關鍵因素。MDR是指腫瘤細胞對分子結構不同、作用機制各異的化療藥物產(chǎn)生的交叉耐藥[1-2]。如何逆轉(zhuǎn)MDR是大腸癌治療中亟待解決的問題。作為細胞死亡的一種方式，自噬(autophagy)與腫瘤耐藥的關系越來越引起人們的關注[3-4]。本研究以此為切入點，通過調(diào)控細胞自噬活性觀察大腸癌多藥耐藥LoVo/Adr細胞對阿霉素(ADR)敏感性的變化，探討自噬對大腸癌MDR的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 多藥耐藥LoVo/Adr細胞株由本研究組采用ADR濃度遞增法誘導大腸癌敏感株LoVo細胞構建，能在1.0mg/L ADR培養(yǎng)基中生長，具有多藥耐藥特性[5]。小牛血清(杭州四季青生物制品研究所)；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)；DAB Kit試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)；兔抗P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔二抗(北京博奧森生物技術有限公司)；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(德國寶靈曼公司)；ADR、噻唑藍(MTT)、西羅莫司(雷帕霉素，RAPA)和單丹磺酰戊二胺(MDC，Sigma公司)；青霉素和鏈霉素(華北制藥廠)；Model 550型酶聯(lián)免疫檢測儀、垂直式電泳儀及濕轉(zhuǎn)裝置(美國Bio-Rad公司)；FACS-420型流式細胞儀(美國Coulter公司)；日立H-600Ⅳ透射電鏡(日本日立公司)。MDR1引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) LoVo/Adr細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%熱滅活小牛血清、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640，在培養(yǎng)體系中加入終濃度為1.0mg/L的ADR以維持耐藥。每48h換液1次，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 電鏡及熒光顯微鏡下觀察LoVo/Adr細胞自噬體變化 實驗分為對照組、ADR組、RAPA組和ADR+RAPA組。取對數(shù)生長期LoVo/Adr細胞，消化后以每孔6×104個細胞加入到24孔板(150μl/孔)中，各組細胞加用相應藥物(ADR終濃度3mg/L，RAPA終濃度50μmol/L)培養(yǎng)24h，胰酶消化，PBS洗5min×3次，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，系列乙醇脫水，氧化丙烯浸透，環(huán)氧樹脂包埋并制成切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。將上述各組細胞加入相應藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，PBS洗2次，加入0.1mmol/L MDC，37℃培養(yǎng)箱孵育2h，熒光顯微鏡下觀察，攝片，熒光顯微鏡加用488nm發(fā)射濾片和570nm阻斷濾片。

1.2.3 流式細胞術定量分析LoVo/Adr細胞自噬率將上述各組細胞制成單細胞懸液，MDC染色，上流式細胞儀，以488nm激發(fā)波長測定3000個細胞，MDC陽性細胞率即為自噬率，結果用Cellquest軟件分析。實驗重復3次。

1.2.4 MTT法檢測RAPA對LoVo/Adr細胞ADR敏感性的影響 將LoVo/Adr細胞分為對照組和RAPA組。取對數(shù)生長期LoVo/Adr細胞，消化后以每孔1×104個細胞加入到96孔板(200μl/孔)中。RAPA組ADR給藥前1h加入終濃度50μmol/L的RAPA，ADR終濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、 1.28、2.56、5.12mg/L共9個濃度梯度，每孔設3個平行孔。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h后取出，加入MTT溶液，培養(yǎng)箱孵育4h，棄培養(yǎng)基，加入DMSO，37℃保溫箱中放置10min，取出震蕩幾秒鐘，使結晶物充分溶解，用酶標儀在570nm處測定吸光度(A)值，重復3次，取平均值。計算ADR對LoVo/Adr細胞的抑制率。以藥物濃度為橫軸，存活率為縱軸繪制濃度效應曲線，確定半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.5 RT-PCR檢測RAPA對MDR1基因表達的影響實驗分對照組和RAPA組。細胞培養(yǎng)方法及加藥情況同1.2.4，再培養(yǎng)24h后，采用異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA。引物按文獻[6]設計合成。MDR1：正義5'-AAGCTTAGTACCAAAGAGGCTCTG-3'，反義5'-GGCTAGAAACAATAGTGAAAACAA-3'，擴增片段長度為243bp；β2-微球蛋白(β2-MG)：正義5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，反義5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'，擴增片段長度為115bp。RT-PCR參照試劑盒說明書操作。50℃反轉(zhuǎn)錄30min后行PCR反應：94℃ 30s，52℃ 30s，60℃ 45s，共35個循環(huán)；60℃延伸10min。取擴增產(chǎn)物10μl，在含有溴化乙啶(EB，終濃度為0.5μg/ml)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，激光密度掃描儀掃描凝膠，用Gelbase/Gelblotpro軟件進行分析，以β2-MG作為內(nèi)參照對PCR產(chǎn)物進行相對定量，實驗重復3次，取平均值。

1.2.6 Western blotting檢測RAPA對P-gp蛋白表達的影響 細胞分組同1.2.4，加入適量裂解液提取蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白量并定量，使各組蛋白濃度一致，行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗以及β-actin的一抗4℃孵育過夜，加入二抗孵育1h，TBST室溫洗膜5min×3次，DAB顯色，照相。條帶經(jīng)Quantity One軟件分析并計算A值。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS軟件進行分析。數(shù)據(jù)結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 電鏡下LoVo/Adr細胞的自噬狀態(tài) 如圖1所示，對照組LoVo/Adr細胞中可見散在的雙層膜結構、含胞質(zhì)成分的自噬體；分別給予自噬體激動劑RAPA或ADR時，LoVo/Adr細胞中的自噬體較對照組顯著增多；同時加入RAPA及ADR時，細胞中出現(xiàn)大量自噬體。

圖1 電鏡下觀察LoVo/Adr細胞自噬體Fig.1 Autophagosomes in LoVo/Adr cells observed by transmission electronic microscopy

2.2 熒光顯微鏡下LoVo/Adr細胞自噬體形成情況熒光顯微鏡觀察結果如圖2所示，與電鏡觀察結果基本一致：常態(tài)下對照組LoVo/Adr細胞內(nèi)可見少量點狀綠色熒光，分布于胞質(zhì)及核周；加入RAPA或ADR后，細胞中點狀綠色熒光顯著增多，同時加入RAPA及ADR時，細胞中出現(xiàn)大量綠色熒光。

圖2 熒光顯微鏡下觀察LoVo/Adr細胞自噬體Fig.2 Fluorescence microscopy used to confirm autophagosomes in LoVo/Adr cells

2.3 流式細胞儀定量分析LoVo/Adr細胞自噬率對照組LoVo/Adr細胞為低自噬狀態(tài)，自噬率為3.1%±0.5%，單獨應用ADR和RAPA時自噬率均較對照組顯著增高，分別為33.6%±5.1%和45.2%±6.1%(P＜0.05)；ADR與RAPA共同作用時自噬率為76.2%±7.4%，較兩者單獨應用時顯著增高(P＜0.05)，表明二者具有協(xié)同作用(圖3)。

圖3 FCM檢測各組LoVo/Adr細胞的自噬率Fig.3 Flow cytometric analysis of autophagy rate in LoVo/Adr cells

2.4 RAPA對LoVo/Adr細胞ADR敏感性的影響LoVo/Adr細胞ADR的IC50值為3.05±0.52mg/L，加入濃度為50μmol/L的RAPA時細胞ADR的IC50值降至1.12±0.21mg/L(P＜0.01)，提示自噬激動劑RAPA可顯著提高LoVo/Adr細胞對ADR的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍。

2.5 RAPA對MDR1基因表達的影響 LoVo/Adr細胞的MDR1 mRNA呈高水平表達(1.42±0.31)，加入RAPA后，其表達量顯著下降(0.54±0.20，P＜0.05，圖4)。

2.6 RAPA對P-gp蛋白表達的影響 P-gp蛋白表達與MDR1 mRNA表達基本一致，在LoVo/Adr細胞中，P-gp蛋白呈高表達(0.67±0.14)，RAPA作用后P-gp蛋白表達明顯下降(0.15±0.08，P＜0.05，圖5)，表明自噬活性可影響MDR1的蛋白表達。

3 討 論

自噬又稱為Ⅱ類程序性細胞死亡，是細胞對于營養(yǎng)不足或代謝應激作出的一種分解代謝反應[7]。自噬的主要功能是通過降解未進行正確折疊或發(fā)生凝聚的蛋白質(zhì)和細胞器來維持細胞內(nèi)的代謝平衡[8-9]。盡管細胞自噬的調(diào)控過程十分復雜，但是已有明確的實驗證據(jù)顯示，自噬可單獨作用或與凋亡共同作用，從而影響腫瘤對化療藥物的敏感性。綜合國內(nèi)外研究成果，發(fā)現(xiàn)自噬與MDR關系存在兩種截然相反的結論，如Galoian等[10]認為自噬增強可逆轉(zhuǎn)耐藥，而Ahn等[11]的研究表明抑制自噬可增加藥物敏感性。為此，我們通過調(diào)控多藥耐藥的大腸癌LoVo/Adr細胞的自噬活性，觀察耐藥指數(shù)的變化，進一步明確自噬與耐藥的關系，并探討可能的發(fā)生機制。

圖4 LoVo/Adr細胞中mdr1 mRNA表達的RT-PCR電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of RT-PCR amplification of mdr1 mRNAs in LoVo/Adr cells

圖5 LoVo/Adr細胞中P-gp蛋白表達的Western blotting檢測Fig.5 Protein expression of P-gp in LoVo/Adr cells by Western blotting

RAPA是mTOR特異性抑制劑，具有阻止mTOR通路、促進自噬的作用，是特異性的自噬激動劑[12]。本研究首先通過RAPA干預耐藥LoVo/Adr細胞，再定性及定量地觀察細胞的自噬活性，結果表明，耐藥LoVo/Adr細胞呈低自噬狀態(tài)，單獨給予ADR或RAPA時，均可使細胞自噬活性增強，而二者聯(lián)合應用時具有協(xié)同作用。雖然ADR與RAPA均可引起細胞的自噬活性增強，但其機制不同：自噬是細胞的一種防御應激反應，ADR作為不良刺激增強了細胞的防御機制，表現(xiàn)為自噬活性增加，從而清除化療殺傷的一些細胞器，隔離有害物質(zhì)，促進細胞逃避藥物誘導的死亡的發(fā)生，發(fā)揮保護作用，而過度的自噬可引發(fā)自噬性死亡；RAPA作為mTOR抑制劑，可抑制mTOR通路，激活自噬，引起細胞自噬活性增強。

進一步觀察自噬活性變化對大腸癌LoVo/Adr細胞ADR敏感性的影響發(fā)現(xiàn)，自噬激動劑RAPA可顯著提高LoVo/Adr細胞對ADR的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，逆轉(zhuǎn)倍率為2.26倍，提示抑制自噬可提高腫瘤細胞的化療敏感性，與Eum等[13]的研究結果一致。大多數(shù)學者認為該逆轉(zhuǎn)機制可能與RAPA通過增加自噬啟動細胞主動性Ⅱ型細胞死亡程序，導致細胞自噬性死亡，從而逆轉(zhuǎn)耐藥有關。

P-gp是耐藥細胞膜上過度表達的一種跨膜大分子糖蛋白[14]，由MDR1基因編碼，分子量為170kD，其主要功能是在細胞膜上形成一個通道，水解ATP獲得能量，將已進入胞內(nèi)的藥物泵出胞外，使細胞內(nèi)藥物濃度降低，從而免遭化療藥物的殺傷[15]。為了研究自噬調(diào)控MDR是否與MDR1基因的表達有關，我們又進行了深入研究，結果表明：自噬活性增高可下調(diào)MDR1基因的mRNA及蛋白表達水平，從而減少細胞內(nèi)藥物的外泵，增強細胞毒性作用，具有增敏作用。Pop等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，在多藥耐藥的B淋巴細胞系中，RAPA能使P-gp泵失活，與本研究結果類似。

總之，本研究觀察到耐藥細胞呈低自噬狀態(tài)，ADR可通過提高耐藥細胞的自噬活性而逆轉(zhuǎn)耐藥，其逆轉(zhuǎn)途徑可能與促進細胞自噬性死亡和下調(diào)mdr1基因的表達有關。由于自噬調(diào)控機制十分復雜，很多問題仍未闡明，甚至存在許多疑問和矛盾，但可以證實的是調(diào)控自噬有助于恢復大腸癌細胞對化療的敏感性，細胞自噬有望成為潛在的逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的治療靶點。

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Effects of autophagy on multidrug resistance of drug resistant LoVo/Adr cells of colon carcinoma

MA Qiang, CHANG Zong-hong, WANG Biao-meng, WANG Wei, DENG Shang-xin
Department of Gastroenterology, General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China

ObjectiveTo observe the effects of autophagy on multidrug resistance (MDR) of drug resistant LoVo/Adr cells of colon carcinoma.MethodsThe formation of autophagosomes was monitored with transmission electron microscopy, and autophagy rate was measured with the aid of MDC staining and flow cytometry. IC50value of adriamycin (ADR) on colon carcinoma cells was detected by MTT assay. The mRNA level of MDR1 gene was measured by RT-PCR, and P-gp protein expression was detected by Western blotting.ResultsThe sporadic autophagosomes or green epoptic dots were found to distribute in LoVo/ Adr cells with an autophagy rate of 3.1%±0.5%. A large number of autophagosomes were seen after being treated with ADR or rapamycin (RAPA) with the autophagy rates of 33.6%±5.1% and 45.2%±6.1%, respectively (P＜0.05). After being treated with ADR combining RAPA, autophagosomes appeared abundantly with an autophagy rate of 76.2%±7.4%, which was significantly higher than that when treated with ADR or RAPA alone (P＜0.05). The IC50value of LoVo/Adr cells on ADR was 3.05±0.52mg/L, which decreased to 1.12±0.21mg/L after being treated with RAPA (P＜0.01). RAPA could reverse MDR with a reversal ratio of 2.26. High expression of mRNA and protein of MDR1 gene were observed in LoVo/Adr cells. When treated with RAPA, the expression of MDR1 mRNA decreased from 1.42±0.31 to 0.54±0.20 (P＜0.05), and the expression of P-gp protein also decreased significantly from 0.67±0.14 to 0.15±0.08 (P＜0.01).ConclusionMDR LoVo/Adr cell shows a low autophagic activity, and RAPA can reverse MDR by increasing autophagy activity. The reversal path might be related with the increase of cell autophagic death and the decrease in MDR1 gene expression in LoVo/Adr cells.

autophagy; multidrug resistance-associated proteins; P-glycoprotein; colorectal neoplasms

R735.35

A

0577-7402(2013)11-0900-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.11.007

2013-06-27；

2013-9-03)

(責任編輯：熊曉然)

馬強，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師。主要從事大腸癌疾病的基礎及臨床研究工作

730050 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院消化科(馬強、常宗宏、王彪猛、王維、鄧尚新)