肖恒，王海霞，陶崑，劉鑫，鐘梁，黃世峰，馮文莉

CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在K562細(xì)胞中的定位及其與BCR-ABL蛋白的相互作用

肖恒，王海霞，陶崑，劉鑫，鐘梁，黃世峰，馮文莉

目的研究CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA兩種融合肽在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)K562細(xì)胞中的定位及其與BCR-ABL蛋白的相互作用。方法將前期制備的CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽轉(zhuǎn)導(dǎo)入K562細(xì)胞，采用免疫熒光和Western blotting方法檢測(cè)其入胞情況及胞內(nèi)定位，His-pull down和CoIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合肽與BCR-ABL的相互作用。結(jié)果免疫熒光檢測(cè)顯示CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并定位于胞質(zhì)，Western blotting也同時(shí)檢測(cè)到進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的兩種融合肽。His-pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽在細(xì)胞外均可直接與BCR-ABL蛋白結(jié)合，CoIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種融合肽在K562細(xì)胞內(nèi)也能與BCR-ABL蛋白結(jié)合并形成復(fù)合物。結(jié)論CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均能成功進(jìn)入白血病K562細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì)，且可與BCR-ABL蛋白發(fā)生相互作用。

白血病，粒-單核細(xì)胞，慢性；融合蛋白質(zhì)類，bcr-abl

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種以形成BCR-ABL融合基因?yàn)樘卣鞯脑煅杉?xì)胞惡性克隆增殖性疾病[1-2]，其表達(dá)生成的BCR-ABL癌蛋白可使ABL激酶持續(xù)活化，從而導(dǎo)致CML的發(fā)生。目前，CML的主要治療藥物為伊馬替尼，但近年來(lái)耐藥情況日益嚴(yán)重[3-5]，因此，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)。寡聚化結(jié)構(gòu)域(oligomerization domain，OD)是位于BCR-ABL蛋白N端的重要結(jié)構(gòu)域，由72個(gè)氨基酸構(gòu)成，即BCR1-72。有研究證實(shí)可通過(guò)靶向該OD域達(dá)到治療CML的目的[6-8]。近來(lái)有報(bào)道指出，OD域中起關(guān)鍵作用的是第30–63位氨基酸[9]。因此，本課題組前期分別制備了含BCR30-63的CTP-OD2-HA融合肽和含BCR1-29+64-72的CTP-OD1-HA融合肽。本研究以含BCR1-72的CTP-OD-HA融合肽為陽(yáng)性對(duì)照，不含BCR1-72的CTP-HA融合肽及PBS為陰性對(duì)照，檢測(cè)上述兩種融合肽的入胞能力及定位，并研究其在胞外和胞內(nèi)與BCR-ABL蛋白的相互作用，為后續(xù)檢測(cè)其生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)所需胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液干粉購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，鼠抗HA抗體、兔抗c-ABL抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal公司，山羊抗鼠Cy3抗體、DAPI染料購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CoIP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Ni-NTA His純化柱購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，正常山羊血清封閉液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞株及融合肽 慢性粒細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株K562細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，能穩(wěn)定表達(dá)BCR-ABL融合蛋白。CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-OD-HA和CTP-HA融合肽由本課題組前期表達(dá)純化獲得。

1.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)融合肽入胞情況 將K562細(xì)胞常規(guī)換液，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中分別加入終濃度為4μmol/L的CTP-OD-HA、CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-HA融合肽和PBS，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6h。離心收集細(xì)胞后，涂片、干燥、固定，先后孵育鼠抗-HA抗體(1:1000稀釋)和Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(1:1000稀釋)，并進(jìn)行DAPI復(fù)染，封片觀察結(jié)果。

1.4 Western blotting檢測(cè)融合肽入胞情況 為了證明CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽可以在細(xì)胞中與BCR-ABL相互結(jié)合，并排除其結(jié)合能力的差異不是由融合肽進(jìn)入細(xì)胞的量所造成的差異，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：K562細(xì)胞培養(yǎng)同上，在含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中分別加入終濃度為60μmol/L的CTP-OD-HA、CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA、CTPHA融合肽和PBS，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。離心收集細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后孵育鼠抗HA多克隆抗體(1:1000稀釋)和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1:1000稀釋)，化學(xué)發(fā)光顯影，以檢測(cè)各融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的含量是否一致。

1.5 His-pull down檢測(cè)CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA與BCR-ABL蛋白的相互作用 離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，并均分成4份。將提取的蛋白與預(yù)先結(jié)合了融合肽的Ni-NTA His純化柱混合，4℃緩慢結(jié)合約1h，漂洗后進(jìn)行洗脫，并留取洗脫液。以不加蛋白提取液的Ni-NTA His純化柱作為原核表達(dá)融合肽陽(yáng)性對(duì)照，不加Ni-NTA His純化柱的蛋白提取液作為BCR-ABL融合蛋白陽(yáng)性對(duì)照，兩種對(duì)照處理方法同上。Western blotting檢測(cè)上述洗脫液中的融合肽和BCR-ABL融合蛋白。

1.6 CoIP檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA與BCR-ABL蛋白的相互作用 在K562細(xì)胞中分別加入終濃度為60μmol/L的CTP-OD-HA、CTPOD1-HA、CTP-OD2-HA、CTP-HA融合肽和PBS，于37℃、5%CO2條件下孵育24h。離心收集細(xì)胞，使用CoIP試劑盒內(nèi)的非變性蛋白裂解液提取蛋白，并加入PMSF防止蛋白降解，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白提取液與CoIP試劑盒內(nèi)抗HA抗體的瓊脂糖磁珠充分混勻，4℃攪拌過(guò)夜。離心棄上清，將瓊脂糖磁珠用PBS洗滌后，加入CoIP試劑盒中的2×上樣緩沖液，沸水煮5min。Western blotting檢測(cè)融合肽和BCR-ABL融合蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光檢測(cè)融合肽入胞情況 K562細(xì)胞分別經(jīng)CTP-OD1-HA、CTP-OD2-HA融合肽及CTPOD-HA、CTP-HA處理后，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)，被Cy3標(biāo)記的紅色熒光主要出現(xiàn)在胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核被DAPI染為藍(lán)色，而PBS組僅見(jiàn)DAPI的藍(lán)色熒光(圖1)。由此可見(jiàn)融合肽可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并定位于胞質(zhì)中。

2.2 Western blotting檢測(cè)融合肽入胞情況 Western blotting結(jié)果顯示，4種融合肽蛋白條帶與β-actin的比值無(wú)明顯差異(圖2)，即進(jìn)入細(xì)胞的含量相同。

2.3 His-pull down檢測(cè)細(xì)胞外融合肽與BCR-ABL蛋白的相互作用 與陽(yáng)性對(duì)照融合肽CTP-OD-HA相比，BCR-ABL融合蛋白均可以被融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA“pull down”。CTP-HA中由于不含OD域中的任何結(jié)構(gòu)，因此，沒(méi)有BCR-ABL可以被“pull down”(圖3)。以上結(jié)果說(shuō)明CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽均可與BCR-ABL蛋白結(jié)合。

圖2 Western blotting檢測(cè)K562細(xì)胞中融合肽的含量Fig.2 Contents of fusion peptides in K562 cells detected by Western blotting

圖3 His-pull down檢測(cè)融合肽與BCR-ABL的相互作用Fig.3 Interaction of BCR-ABL with fusion peptides detected by His-pull down assay

2.4 CoIP檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)融合肽與BCR-ABL蛋白的相互作用 K562細(xì)胞內(nèi)分別加入融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA后，融合肽均可與BCR-ABL結(jié)合。與陽(yáng)性對(duì)照CTP-OD-HA相比，兩種融合肽的結(jié)合能力較弱，CTP-OD1-HA的結(jié)合力強(qiáng)于CTP-OD2-HA(圖4)。

3 討 論

圖4 CoIP檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)融合肽與BCR-ABL的相互作用Fig.4 Detection of interaction of fusion peptides with BCRABL in K562 cells by CoIP assay

CML是由于BCR-ABL融合蛋白形成導(dǎo)致酪氨酸激酶異?；罨瑥亩鸸撬柙煅杉?xì)胞惡性增殖的疾病[10]。深入研究BCR-ABL的結(jié)構(gòu)有利于開(kāi)發(fā)新的治療CML的小分子藥物[11]。研究顯示，可通過(guò)蛋白-蛋白之間的相互作用篩選出具有高親和力、高穩(wěn)定性的小分子多肽或小分子化合物作為治療疾病的小分子藥物的前體[12]，同時(shí)研究蛋白-蛋白的相互作用也是對(duì)小分子蛋白進(jìn)行修飾的前提條件[13]。Pull down和CoIP實(shí)驗(yàn)作為研究蛋白-蛋白相互作用的常用研究方法，可以確定蛋白相互作用的氨基酸區(qū)域[14]，其中Pull down實(shí)驗(yàn)可以在細(xì)胞外研究蛋白-蛋白之間的相互作用，而其在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用則通過(guò)CoIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

從BCR1-72晶體結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，BCR30-63在BCR1-72四聚體化后對(duì)BCR-ABL激酶的活化中起重要作用，但仍未有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，除BCR30-63以外，BCR1-29+64-72是否有生物學(xué)功能也仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Pull down和CoIP兩種方法探討CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合肽與BCR-ABL之間的相互關(guān)系，結(jié)果表明兩種融合肽均可通過(guò)信號(hào)肽CTP的作用進(jìn)入K562細(xì)胞并定位于胞質(zhì)，且無(wú)論在胞外還是胞內(nèi)，二者均可與BCR-ABL結(jié)合，但是CTP-OD1-HA與BCR-ABL蛋白的親和力強(qiáng)于CTP-OD2-HA，可能是由于OD1和OD2與BCR-ABL結(jié)合的部位不同、空間位阻不同所致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)的融合肽CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA可成功跨膜入胞，定位于胞質(zhì)，并可與BCR-ABL蛋白相結(jié)合，為后續(xù)深入研究?jī)煞N融合肽的生物學(xué)功能和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Location of CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptide in K562 cells and its interaction with BCR-ABL protein

XIAO Heng, WANG Hai-xia, TAO Kun, LIU Xin, ZHONG Liang, HUANG Shi-feng, FENG Wen-li*
Department of Clinical Hematology, Key Laboratory of Laboratory Medical of Education Ministry, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
*

, E-mail: fengwlcqmu@sina.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30670901, 30871102)

ObjectiveTo investigate the intracellular location of cytoplasmic transduction peptide-oligomerization domain 1-hemagglutinin (CTP-OD1-HA) and cytoplasmic transduction peptide-oligomerization domain 2-hemagglutinin (CTP-OD2-HA) fusion peptide and interaction with BCR-ABL protein in chronic myelocytic leukemia (CML) K562 cells.MethodsThe prepared CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptide were transduced into K562 cells, and the cytoplasmic transduction peptideoligomerization domain-hemagglutinin (CTP-OD-HA) peptide was used as positive control, and cytoplasmic transduction peptidehemagglutinin (CTP-HA) and PBS were used as negative control. The intracellular location of the fusion peptide was demonstrated by immunofluorescence and Western blotting. The interactions between the fusion peptides and BCR-ABL protein were detected by His-pull down and CoIP test.ResultsImmunofluorescence assay showed that both fusion peptides CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA could penetrate the cell membrane, and they were mainly localized in cytoplasm. Western blotting also confirmed the existence of the two fusion peptides in the cytoplasm. His-pull down showed that CTP-OD1-HA and CTP-OD2-HA could directly bind BCRABL protein outside the cells, and CoIP experiment showed that both fusion peptides could interact with BCR-ABL protein and form complex in the K562 cells. The negative control CTP-HA fusion peptide and PBS showed no such effects.ConclusionCTPOD1-HA and CTP-OD2-HA fusion peptides can successfully target into CML K562 cells and locate in cytoplasm, and it interacts with BCR-ABL protein.

leukemia, myelomonocytic, chronic; fusion proteins, bcr-abl

R733.7

A

0577-7402(2013)11-0896-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.11.006

2013-07-03；

2013-09-11)

(責(zé)任編輯：李恩江)

國(guó)家自然科學(xué)基金(30670901、30871102)

肖恒，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事白血病的分子機(jī)制及基因治療研究

400016 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(肖恒、王海霞、陶崑、劉鑫、鐘梁、黃世峰、馮文莉)

馮文莉，E-mail: fengwlcqmu@sina.com