李亞琳

新城疫病毒對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的抑制作用研究

李亞琳

目的觀察新城疫病毒(NDV)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的抑制作用。方法昆明小鼠腹腔注射CCl4/花生油溶液，每周2次，連續(xù)8周，制作肝纖維化模型。最后一次CCl4注射后3d由尾靜脈注射NDV 1次或3次，每次注射間隔24h，注射完畢24h后處死動(dòng)物。取出肝臟進(jìn)行大體形態(tài)觀察，行HE和天狼猩紅染色觀察肝組織病理學(xué)改變，Western blotting檢測(cè)肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)。結(jié)果CCl4誘導(dǎo)8周后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯纖維化表現(xiàn)，可見肝臟質(zhì)硬、表面粗糙不平、大量密集分布的白色點(diǎn)狀斑塊。HE染色顯示纖維化肝臟組織結(jié)構(gòu)松散，竇周隙增大。天狼猩紅染色顯示膠原異常沉積。而NDV注射3次后，小鼠肝臟表面白色斑點(diǎn)顯著減少，膠原沉積降低。Western blotting結(jié)果表明，α-SMA表達(dá)水平隨NDV注射次數(shù)增加而降低。結(jié)論NDV能有效抑制CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

新城疫病毒；肝硬化，實(shí)驗(yàn)性；四氯化碳

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副黏病毒科，具有天然的在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的特點(diǎn)[1-2]。1976年，McGregor等[3]報(bào)道了NDV能夠在活化的T細(xì)胞中復(fù)制，并導(dǎo)致活化T細(xì)胞死亡。Fábián等[4]也報(bào)道了NDV能在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中高效復(fù)制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NDV能夠在活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stem cells，HSC)中高效復(fù)制，并抑制HSC活化[5]。本研究以此為基礎(chǔ)，建立小鼠肝纖維化模型，探討NDV在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)小鼠肝纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 昆明小鼠購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重約20g；鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗(英國(guó)Abcam公司)；雞抗NDV一抗和兔抗雞IgY-FITC二抗(美國(guó)USBiological公司)；羊抗鼠Alexa Fluor 594-IgG二抗(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.2 小鼠肝纖維化模型建立及分組 30只小鼠隨機(jī)分成生理鹽水(PS)對(duì)照組和CCl4組，每組15只。CCl4組小鼠按1ml/kg腹腔注射100μl CCl4/花生油溶液(20%，V/V)，每周2次，連續(xù)注射8周，以形成完全的肝纖維化。對(duì)照組注射等量PS。每組再分3個(gè)亞組，即PS組(腹腔注射PS)、NDV1組(最后一次CCl4注射后3d通過尾靜脈注射1000HU NDV，200μl)和NDV2組(最后一次CCl4注射后3d按上述劑量，每間隔24h注射NDV 1次，共3次)，每組5只。所有小鼠均在NDV注射完成后24h處死。

1.3 大體形態(tài)觀察及組織切片染色 小鼠處死后，解剖取出肝臟，肉眼觀察大體形態(tài)。組織樣品依次用4%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后切成4μm厚的切片，切片進(jìn)一步經(jīng)過脫蠟、水化，行常規(guī)HE和天狼猩紅染色。

1.4 Western blotting檢測(cè)肝組織中α-SMA的表達(dá)取新鮮肝組織50mg，加入400μl RIPA裂解液，冰上勻漿2～3min，4℃下12 000r/min離心10min，取上清分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)試劑盒說明采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣品取50μg總蛋白上樣并行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加鼠抗人α-SMA一抗(1:100稀釋)4℃孵育過夜；用TBST在搖床上洗膜4次，每次5min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1:5000稀釋)，室溫孵育1h；TBST洗膜4次，每次10min；采用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝臟大體觀察 正常肝臟表面光滑、柔軟，顏色呈深棕色，可見肝組織中較豐富的小血管(圖1A)。CCl4誘導(dǎo)8周后，小鼠肝臟稍微偏大、變硬，表面粗糙且有大量白色點(diǎn)狀病變結(jié)節(jié)(圖1B)。經(jīng)尾靜脈注射NDV 1次后，肝臟表面的纖維化表現(xiàn)稍有減輕，連續(xù)注射NDV 3次后，肝臟表面變光滑，點(diǎn)狀白色病變減少并變?nèi)酰w維化表現(xiàn)明顯減輕(圖1C)。

圖1 NDV對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的抑制作用Fig.1 Depressant effects of NDV on hepatic fibrosis of mice induced by CCl4

2.2 肝組織中膠原纖維的變化 如圖2所示，對(duì)照組小鼠僅在血管周圍有少量膠原纖維。CCl4誘導(dǎo)8周后，小鼠肝組織中的膠原纖維明顯增多，不僅在血管周圍，而且在新形成的假小葉組織中也出現(xiàn)大量的膠原纖維。注射NDV 3次后，這些誘導(dǎo)出現(xiàn)的膠原纖維急劇減少(圖2)。

圖2 肝組織膠原纖維的天狼猩紅染色Fig.2 Sirius red staining of hepatic collagen fibers of mouse

2.3 肝組織α-SMA的表達(dá) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)8周后小鼠肝組織中有大量α-SMA表達(dá)；注射1次NDV后，α-SMA表達(dá)明顯減少；注射3次NDV后，組織中僅有少量α-SMA表達(dá)。未經(jīng)誘導(dǎo)以及注射了3次NDV的對(duì)照組中均未檢測(cè)到α-SMA表達(dá)(圖3)。

圖3 Western blotting 檢測(cè)肝組織中α-SMA的表達(dá)Fig.3 Expression of α-SMA detected by Western blotting

3 討 論

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NDV能在活化的LX-2細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致活化細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抑制HSC活化的目的[5]。靶向HSC的纖維化治療已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[6-7]。本研究將體外模型運(yùn)用到體內(nèi)，采用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，通過尾靜脈注射NDV，觀察NDV在體內(nèi)抑制HSC活化并逆轉(zhuǎn)小鼠肝纖維化的作用。

本研究小鼠肝臟大體觀察表明，NDV注射明顯地逆轉(zhuǎn)了已經(jīng)形成的肝纖維化，肝臟外觀形態(tài)改善顯著。組織中膠原纖維的沉積是肝纖維化的主要特征，采用天狼猩紅染色法檢測(cè)組織中膠原纖維的含量，結(jié)果表明NDV注射后纖維化組織中沉積的膠原纖維明顯減少。

α-SMA表達(dá)是HSC活化的標(biāo)志，也是評(píng)估肝纖維化程度的重要指標(biāo)之一[8-11]。Western blotting結(jié)果顯示，在未用CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織中檢測(cè)不到α-SMA表達(dá)，而CCl4誘導(dǎo)后小鼠肝組織中α-SMA表達(dá)量明顯上調(diào)。隨著NDV注射次數(shù)的增加，α-SMA的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。該結(jié)果與肝臟形態(tài)觀察以及天狼猩紅染色結(jié)果一致，均表明NDV能夠逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肝纖維化。

有報(bào)道顯示，NDV感染能引起小鼠和雞強(qiáng)烈而持久的免疫反應(yīng)[12-13]。本研究中小鼠纖維化模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示NDV確實(shí)能夠在體內(nèi)抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，而且比其在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)活化HSC的抑制效果更明顯，這可能是因?yàn)樵隗w內(nèi)NDV的感染刺激了機(jī)體本身的免疫系統(tǒng)，使其活性大大增加，從而加強(qiáng)了自身免疫系統(tǒng)抗纖維化的能力。由于NDV天然的溶瘤特性，其在活化HSC中的復(fù)制促進(jìn)了活化細(xì)胞的死亡，明顯降低了活化HSC的增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等生物學(xué)能力，從而起到逆轉(zhuǎn)肝纖維化、控制肝纖維化進(jìn)程的作用。

NDV的這種選擇性在非正常的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及活化細(xì)胞中復(fù)制的特性，為其作為生物工具用于疾病治療提供了一個(gè)安全而有效的平臺(tái)。然而，本研究利用NDV在活化HSC中高效復(fù)制的特點(diǎn)而將其用于肝纖維化治療的研究只是一個(gè)初探，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

[1] Li YL. The study progress of application of Newcastle disease virus in tumor therapy[J]. Prog Vet Med, 2012, 33(8): 97-100. [李亞琳. 新城疫病毒在腫瘤治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(8): 97-100.]

[2] Ren Z, Wei D, Nan G, et al. Construction and identification of helper plasmids of newcastle disease virus Italien strain[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(7): 702-706. [任臻, 尉丁, 南剛, 等. 新城疫病毒Italien株輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 37(7): 702-706.]

[3] McGregor DD, Logie PS, Carmichael LE. The mediator of cellular immunity. Ⅻ. Inhibition of activated T cells by Newcastle disease virus[J]. J Exp Med, 1976, 144(3): 627-643.

[4] Fábián Z, Csatary CM, Szeberényi J, et al. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines[J]. J Virol, 2007, 81(6): 2817-2830.

[5] Li YL. Newcastle disease virus infects activated human stellate cells LX-2[J]. Basic Clin Med, 2012, 32(10): 1161-1166. [李亞琳. 新城疫病毒感染活化的人肝星狀細(xì)胞系LX-2[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012, 32(10): 1161-1166.]

[6] Bai T, Lian LH, Wu YL, et al. Thymoquinone attenuates liver fibrosis via PI3K and TLR4 signaling pathways in activated hepatic stellate cells[J]. Int Immunopharmacol, 2013, 15(2): 275-281.

[7] Kaji K, Yoshiji H, Ikenaka Y, et al. Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor attenuates hepatic fibrosis via suppression of activated hepatic stellate cell in rats[J]. J Gastroenterol, 2013, [Epub ahead of print].

[8] Akpolat N, Yahsi S, Godekmerdan A, et al. The value of α-SMA in the evaluation of hepatic fibrosis severity in hepatitis B infection and cirrhosis development: a histopathological and immunohistochemical study[J]. Histopathology, 2005, 47(3): 276-280.

[9] Dong R, Luo Y, Zheng S. α-SMA overexpression associated with increased liver fibrosis in infants with biliary atresia[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2012, 55(6): 653-656.

[10] Hao LS, Zhang XL, Zhou ZH, et al. Relationship of PTEN expression with apoptosis of hepatic stellate cells in liver tissues of rats with hepatic fibrosis induced by bile stagnation[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(7): 836-838. [膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝組織中PTEN表達(dá)與肝星狀細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 35(7): 836-838.]

[11] Mak KM, Chu E, Lau KH, et al. Liver fibrosis in elderly cadavers: localization of collagen types Ⅰ, Ⅲ, and Ⅳ, α-smooth muscle actin, and elastic fibers[J]. Anat Rec (Hoboken), 2012, 295(7): 1159-1167.

[12] Hu Z, Hu J, Hu S, et al. Strong innate immune response and cell death in chicken splenocytes infected with genotype Ⅶd Newcastle disease virus[J]. Virol J, 2012, 9: 208.

[13] Schmidt MR, McGinnes LW, Kenward SA, et al. Long-term and memory immune responses in mice against Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus glycoprotein ectodomains[J]. J Virol, 2012, 86(21): 11654-11662.

Inhibitory effect of Newcastle disease virus on hepatic fibrosis induced by CCl4

LI Ya-lin
College of Chemistry and Life Science, Weinan Normal College, Weinan, Shaanxi 714000, China,
This work was supported by the Education Department of Shaanxi Province Foundation(009KJ427)and Weinan Normal College Foundation (10YKZ054)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of Newcastle diseases virus (NDV) on CCl4-induced liver fibrosis in mice.MethodsLiver fibrosis model was reproduced in 30 Kunming mice by intraperitoneal injection of CCl4/peanut oil solution for 2 times a week, and the total treatment lasted for 8 weeks. Three days after last injection, NDV was injected through tail vein for 1 or 3 times (24h intervals). Twenty-four hours after NDV infusion, mice were sacrificed and the livers were removed for gross morphology observation. The liver tissue sections were stained by HE and Sirius red dyeing. α-smooth muscle actin (α-SMA) expression was detected by Western blotting.ResultsAfter CCl4induction for 8 weeks, obvious fibrosis symptoms appeared in the liver of model mice, and the surface of liver tissue became hard with rough, with white patches on it. HE staining showed that there was loosening of tissue and enlarged perisinusoidal spaces in liver with fibrosis. Sirius red dyeing displayed abnormal collagen deposition in the fibrotic liver tissues. After NDV injection for 3 times, white spots on the surface of mouse liver were significantly reduced, and collagen deposition was lowered. Western blotting showed that α-SMA levels decreased with increasing frequency of NDV injection.ConclusionNDV may effectively suppress the development of CCl4-induced liver fibrosis in mice.

newcastle disease virus; liver cirrhosis, experimental; carbon tetrachloride

R575.2

A

0577-7402(2013)11-0885-03

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.11.003

2013-07-27；

2013-09-22)

(責(zé)任編輯：熊曉然)

陜西省教育廳資助項(xiàng)目(009JK427)；渭南師范學(xué)院基金資助項(xiàng)目(10YKZ054)

李亞琳，醫(yī)學(xué)博士，副教授。主要從事腫瘤生物治療方面的研究

714000 陜西渭南 渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院(李亞琳)