張陽陽 姚玉珍 李榮榮 劉莉

高血糖對心肌產(chǎn)生直接損傷，誘導(dǎo)凋亡，是糖尿病心肌損傷的獨立危險因素，其機制與產(chǎn)生過多的氧自由基有關(guān)［1］，但具體機制未完全明了。大量文獻顯示，心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子事件［2］。因此，研究高濃度葡萄糖對心肌細胞損傷的機制，以期減少心肌凋亡，延緩糖尿病心肌病及心功能衰竭進程意義重大。

α-硫辛酸(α-lipoic acid，LA)是維生素B 族化合物，能清除自由基，具有抗氧化的作用［3］。臨床資料及動物實驗均證實，LA 可以安全有效地預(yù)防和治療多種疾病，如糖尿病周圍神經(jīng)病變［4］、多發(fā)性硬化癥［5］、帕金森?。?，6］、腦梗死等［7］，其機制與凋亡信號通路ASK1/Daxx 抑制［4］、減輕線粒體老化有關(guān)［2］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，LA 可顯著減輕高濃度葡萄糖/葡萄糖氧化酶(d-glucose/glucose oxidase，DG/GO)所致的心肌細胞損傷。本研究旨在探討LA 對DG/GO 所致心肌細胞損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑LA、DG、GO 購自Sigma 公司。DMEM 細胞培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購自Invitrogen Life Technology 公司。細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿購自Falcon 公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 大鼠心肌細胞株H9c2 來自ATCC，由本實驗室保存。培養(yǎng)在含有10% FCS 的DMEM 培養(yǎng)基中。

1.3 ERK1/2 磷酸化水平測定 細胞分組如下:對照組:正常培養(yǎng);LA 組:培養(yǎng)體系中含有300 μmol/L LA;DG/GO 組:培養(yǎng)體系中含有DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)。于LA 或DG/GO 作用3 h 后收集細胞，以Western blot 法檢測ERK1/2 磷酸化水平。具體方法為:提取胞漿蛋白，10%SDS-PAGE 電泳，封閉、轉(zhuǎn)膜，一抗4 ℃過夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗4 ℃孵育2 h。顯影劑顯色后，暗室曝光在X 光膠片上。ERK的活性測定以磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)與總ERK1/2 的比值表示。實驗進行3 次。

1.4 ERK 磷酸化抑制性實驗 細胞分組如下:對照組:正常培養(yǎng);LA 組:培養(yǎng)體系中含有300 μmol/L LA;PD 組:加入ERK 磷酸化特異性抑制劑PD98059(30 μmol/L );PD + LA 組:加 入 PD98059(30 μmol/L)，30 min 后，再加LA。于LA 作用3 h，收集細胞，以Western blot 法檢測ERK 磷酸化水平。實驗進行4 次。

1.5 細胞存活檢測 細胞分組如下:對照組:正常培養(yǎng);DG/GO 組:用DG(30 mmol/L)及GO(5 mU/ml)刺激細胞;LA +DG/GO 組:用LA(300 μmol/L)預(yù)處理細胞，12 h 后加入DG 及GO;PD+LA +DG/GO 組:加入PD98059(30 μmol/L)30 min，然后加入LA，其余同LA+DG/GO 組。

DG/GO 作用24 h 后，收集細胞，按課題組先前報道方法以四唑鹽比色法(MTT)測定細胞存活［8］。實驗進行5 次。

1.6 細胞凋亡檢測 實驗分組同“細胞存活檢測”。DG/GO 作用24 h 后，按課題組先前報道方法［8］，以Hoechst33342 熒光染色法分析細胞核固縮，以核固縮率作為細胞凋亡的指標(biāo)。實驗進行4 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LA 顯著激活ERK1/2 如圖1 所示，以DG/GO、LA 作用細胞3 h 后，與對照組比較，DG/GO 組和LA組的p-ERK1/2 水平均顯著升高(P ＜0.01)。然而，與DG/GO 組比較，LA 組的p-ERK1/2 水平顯著升高37.9%(P ＜0.01)。

圖1 LA 對ERK1/2 的激活作用

2.2 PD98059 阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用 如圖2 所示，與LA 組比較，PD+LA 組的p-ERK1/2 水平下降了61.4%(P ＜0.01)。與對照組比較，PD +LA 組的p-ERK1/2 水平無顯著差異。

圖2 PD98059(PD)阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用

2.3 PD98059 去除LA 對DG/GO 所致細胞存活率下降的保護作用 如圖3 所示，與對照組比較，DG/GO 使細胞存活率顯著下降了59.5%(P ＜0.01)。與DG/GO組比較，LA +DG/GO 組的存活率顯著提高了94.0%(P ＜0.01)。然而，與LA +DG/GO 組比較，PD +LA +DG/GO 組的存活率下降了72.8%(P ＜0.01)。與對照組比較，LA+DG/GO 組的存活率無顯著差異。

圖3 PD98059(PD)去除LA 對DG/GO所致細胞存活率下降的保護作用

2.4 PD98059 去除LA 對DG/GO 所致細胞凋亡的保護作用 如圖4 所示，與對照組比較，DG/GO 使細胞核固縮率增加了74.5 倍(P ＜0.01)。與DG/GO 組比較，LA+DG/GO 組的核固縮率顯著下降了90.8%(P ＜0.01)。然而，與LA +DG/GO 組比較，PD +LA +DG/GO 組的核固縮率增加了9.7 倍(P ＜0.01)。與DG/GO比較，PD+LA+DG/GO 組的核固縮率無顯著差異。

圖4 PD98059(PD)去除LA 對DG/GO所致細胞凋亡的保護作用

3 討論

長期處于高血糖環(huán)境中，易導(dǎo)致糖尿病患者心功能衰竭，糖尿病病情嚴(yán)重程度及心衰程度與血糖控制不佳密切相關(guān)［9］，大量體內(nèi)及體外研究證實，高濃度葡萄糖可直接致心肌凋亡，機制與產(chǎn)生過量的氧自由基有關(guān)［1］，因此，很有必要探討高濃度葡萄糖致心肌損傷的機制。

糖尿病心肌病發(fā)生在糖尿病中，心肌細胞肥大，在晚期出現(xiàn)心肌間質(zhì)及周圍血管纖維化，由于心肌細胞再生能力差，心肌細胞凋亡過多造成心功能失代償［1］。研究報道，高濃度葡萄糖致心肌細胞凋亡，機制涉及線粒體細胞色素c 釋放及caspase-3 活化及高糖誘導(dǎo)氧自由基增多有關(guān)［1］。

文獻報道，LA 是一種抗氧化劑，廣泛用來治療糖尿病及其并發(fā)癥。LA 通過清除自由基減輕糖尿病神經(jīng)損傷［4］。LA 通過抗氧化應(yīng)激對2 型糖尿病大鼠腎臟產(chǎn)生保護性作用［10］。Kowluru［11］報道長期注射LA延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變進展，機制是通過抑制視網(wǎng)膜毛細血管細胞的凋亡。Palacka 等［12］發(fā)現(xiàn)使用LA 3月能顯著性改善糖尿病人心功能，這些數(shù)據(jù)表明，LA可能通過抗凋亡減輕糖尿病心肌損傷。

本實驗發(fā)現(xiàn)LA 對DG/GO 所致心肌細胞損傷有保護性作用，且LA 可激活H9c2 心肌細胞ERK1/2。以ERK1/2 選擇性抑制劑PD98059 阻斷LA 對ERK1/2 的激活作用后，可完全去除LA 對DG/GO 致心肌細胞損傷保護性作用。我們的結(jié)果顯示，LA 是通過激活ERK1/2 從而減輕DG/GO 所致的心肌損傷的。

ERK1/2 為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，它能調(diào)控各種胞內(nèi)反應(yīng)包括新陳代謝、細胞分化、增殖，細胞的存活與凋亡［13］。Ottani 等［14］發(fā)現(xiàn)JNK/ERK/SATAT 通路介導(dǎo)，減輕黑質(zhì)皮素對大鼠冠脈結(jié)扎心肌缺血再灌注損傷，減少心梗面積及心肌凋亡。有體外實驗報道，丹參酮減少缺氧條件下大鼠H9c2心肌細胞凋亡，該保護作用與ERK1/2 激活相關(guān)［15］。Han 等［16］在新生大鼠腦缺血損傷模型中發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)能提高ERK1/2 的磷酸化水平，使用ERK1/2 抑制劑抑制ERK1/2 活性，能消除BDNF對腦缺血的保護作用。Tsao 等［17］報道色素上皮衍生因子(PEDF)激活ERK1/2，減輕H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜上皮細胞凋亡，使用ERK1/2 抑制劑PD98059 后，PEDF的保護作用顯著減弱。這些數(shù)據(jù)表明，ERK1/2 對細胞的保護作用可能與參與抗氧化應(yīng)激來實現(xiàn)。

綜上，LA 對DG 引起的心肌細胞損傷有顯著保護作用，其機制是通過激活ERK1/2 介導(dǎo)的。除此之外，LA 對糖尿病周圍神經(jīng)病變及糖尿病腎病的保護作用與減少氧自由基有關(guān)［4，10］。Wang 等［18］曾報道，LA 促進神經(jīng)細胞突觸生長，機制與增加ERK1/2蛋白磷酸化水平有關(guān)，并短暫增加氧自由基含量。使用抗自由基制劑N-乙酰半胱胺酸后，ERK1/2 磷酸化水平下降，并且消除LA 促進神經(jīng)細胞突觸生長。因此，LA 對DG引起的心肌細胞操作保護作用，還可能與氧自由基產(chǎn)生有關(guān)。由于適量服用LA 已經(jīng)被證明對人體是安全的，例如有報道使用LA 治療2 型糖尿病患者能明顯改善糖尿病周圍神經(jīng)病變［19］。因此，進一步探索LA對糖尿病心肌病的預(yù)防、治療作用，很有理論意義和實踐價值。

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