趙娜娜 洪梅 魯翔 嚴(yán)臘梅 周海波 賈志強(qiáng)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前嚴(yán)重危害老年人生命健康的最常見心血管疾病，研究證實(shí)炎癥在冠狀動(dòng)脈硬化發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，多種炎癥因子被證實(shí)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［1-2］。脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)作為一種新型炎癥因子，與CHD 的發(fā)生密切相關(guān)。研究報(bào)道表明Lp-PLA2 的V279F、A379V、R92H和I198T 基因的多態(tài)性與CHD 的遺傳易感性具有相關(guān)性［3］，但是對(duì)于V279F 和A379V 基因多態(tài)性對(duì)CHD 的研究結(jié)論尚不一致，而且針對(duì)老年患者的研究較少見［4］，本文利用DNA 測(cè)序方法對(duì)中國(guó)老年漢族人群Lp-PLA2 基因多態(tài)性分布與CHD 遺傳易感性的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011 年2 月至2012 年3 月期間在我院心內(nèi)科住院的老年CHD 患者227 例，其中男119例，女108 例，年齡60 ～89 歲，平均(71.66 ±7.05)歲。對(duì)照組來源于本院健康體檢者101 例，其中男36例，女65 例，年齡60 ～88 歲，平均(66.94 ±6.57)歲。所有入組人員年齡≥60 歲，均行冠狀動(dòng)脈造影檢查，CHD 的診斷符合WHO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。以左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有1 支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%為有意義病變，或者患者有明確心肌梗死病史。所有患者均除外腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、慢性肝腎功能不全等系統(tǒng)性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 監(jiān)測(cè)指標(biāo):記錄患者既往疾病史及吸煙史?？崭?2 h 取靜脈血2 ml，用德國(guó)ROCHE 公司P800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生物化學(xué)指標(biāo)。

1.2.2 外周血白細(xì)胞DNA 的制備:取EDTA 抗凝的靜脈血200 μl，用美國(guó)Invitrogen 公司提供的基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，TE 溶解保存于－20 ℃冰箱中。

1.2.3 Lp-PLA2 基因V279F 和A379V 位點(diǎn)的基因型檢測(cè):Platinum?Taq DNA 聚合酶，定制引物均由美國(guó)Invitrogen 公司提供，V279F 引物序列包括上游引物:5'-TCCAGTGTGGGTGACTACAAA-3'，下游引物 5'-TATGGGGGCAAAAGAATAGC-3';A379V 引物序列包括上游引物:5'-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3'，下游引物5'-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3'。待測(cè)樣品PCR 完畢，1.5% 的瓊脂糖膠鑒定，使用3730XL 型DNA 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SHEsis 軟件分析2 組的Hardy-Weinberg 平衡，組間基因型和等位基因頻率用Fisher's 精確概率檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用非條件logistic 逐步回歸模型分析CHD 主要危險(xiǎn)因素，以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 CHD 組與對(duì)照組在高血壓、TG 水平等方面的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CHD 組的年齡、吸煙比例和糖尿病比例明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，血清TC、HDL-C 及LDL-C 水平則明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05)。見表1。

表1 2 組基本資料比較

2.2 V279F 和A379V 基因型分布和等位基因頻率的比較 V279F 有VV 型、VF 型和FF 型3 種基因型，A379V 包括AA 型、AV 型和VV 型3 種基因型。CHD組與對(duì)照組之間V279F 和A379V 基因型的分布及等位基因頻率:V279F 和A379V 在CHD 組和對(duì)照組之間的分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，V279F和A379V 基因型和等位基因的頻率在CHD 組和對(duì)照組之間分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHD 組的亞組分析:V279F 和A379V 的基因型和等位基因的頻率在心肌梗死組和非心肌梗死組的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2，3。

表2 V279F 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

表3 A379V 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

2.3 單倍型分析 單倍型分析顯示FA、FV、VA、VV 4 種單倍型在CHD 組和對(duì)照組分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 V279F 和A379V 的單倍型分析

2.4 CHD 主要危險(xiǎn)因素的logistic 回歸分析 以是否為CHD 作為因變量，年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、TG、V279F、A379V 為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，在校正傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素后，未發(fā)現(xiàn)V279F 和A379V變異使患者患CHD 的風(fēng)險(xiǎn)增加。

3 討論

Lp-PLA2 又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，是磷脂酶超家族中的一員，主要由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成分泌，以多種亞型分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，Lp-PLA2 屬于非鈣離子依賴型，能夠催化甘油磷脂第2 位?；ユI水解，在血液循環(huán)中主要與脂蛋白顆粒結(jié)合存在，絕大部分與低密度脂蛋白結(jié)合，少量與高密度脂蛋白及極低密度脂蛋白結(jié)合［5-6］。研究證實(shí)Lp-PLA2 的促動(dòng)脈粥樣硬化的作用通過多種細(xì)胞途徑完成，與CHD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是獨(dú)立于傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［7-8］。Guerra 等［9］研究表明LP-PLA2 活性62%受遺傳因素的影響，編碼Lp-PLA2 的基因位于第6 號(hào)染色體p21.2-p12，包含12個(gè)外顯子。在Lp-PLA2 基因多態(tài)性與CHD 相關(guān)性研究方面，日本研究者首先報(bào)道了9 號(hào)外顯子上V279F的變異對(duì)Lp-PLA2 活性的影響，該位點(diǎn)的錯(cuò)義突變使纈氨酸變?yōu)楸奖彼?，雜合突變可使酶活性下降，少數(shù)的純合突變甚至使酶失去活性，增加了日本人口心肌梗死和腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的遺傳因素之一［10］。Liu 等［11］對(duì)臺(tái)灣人群的研究發(fā)現(xiàn)V279F變異與CHD 心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性，Hou等［12］對(duì)中國(guó)漢族人群的研究同樣未發(fā)現(xiàn)V279F 變異能夠增加CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而韓國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)V279F變異可降低CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［13］。隨后Li 等［14］的研究卻發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群的V279F 的突變與CHD 是具有相關(guān)性的，之后更多研究發(fā)現(xiàn)V279F 變異只存在于亞洲人種，并未在高加索人中發(fā)現(xiàn)，而且研究結(jié)果尚有矛盾，結(jié)論不一。此外，早期的Kruse 等［15］研究表明了11 號(hào)外顯子上A379V 的變異降低了Lp-PLA2 與底物親和力，在高加索人過敏癥和哮喘的發(fā)生中可能起著關(guān)鍵作用。而后Ninio 等［16］研究發(fā)現(xiàn)CHD 組A379V 的379V 等位基因的頻率明顯低于對(duì)照組，提出379V 等位基因攜帶者對(duì)心血管有保護(hù)作用，可能降低CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Li 等［14］的研究也同時(shí)指出該A379V 基因突變?cè)黾恿诵募」Ｋ赖娘L(fēng)險(xiǎn)。杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究［4］指出A379V 的突變，可導(dǎo)致Lp-PLA2與底物親和力的降低，與CHD 具有相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)在漢族老年人口中，CHD 組V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與對(duì)照組無明顯差異，心肌梗死組與非心肌梗死組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步進(jìn)行單體型分析未能發(fā)現(xiàn)與CHD 發(fā)病相關(guān)的單體型。在校正傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后進(jìn)行的logistic 回歸分析也未能發(fā)現(xiàn)與CHD 相關(guān)的基因型和等位基因。在本研究中出現(xiàn)了CHD 組的血清TC、HDL-C 以及LDL-C 水平明顯低于對(duì)照組的情況，考慮由于絕大多數(shù)CHD 患者在入院前已經(jīng)服用調(diào)脂藥物治療，導(dǎo)致血脂水平降低。由于本研究總體樣本量較少，在進(jìn)行入組篩選時(shí)將左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%納入CHD組，而對(duì)照組中尚存在一部分有冠脈粥樣硬化病變的患者，從而可能輕度導(dǎo)致V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與CHD 組無明顯差異，在加大樣本量以及分組標(biāo)準(zhǔn)更加細(xì)致化的時(shí)候可能會(huì)避免上述問題，使最后結(jié)果更有意義。

總之，對(duì)中國(guó)老年漢族人群的Lp-PLA2 基因多態(tài)性的研究，與國(guó)內(nèi)的一些研究結(jié)果基本一致，但由于實(shí)驗(yàn)條件所限未能定量定性檢測(cè)Lp-PLA2 的活性，未能更加明了直觀地分析V279F 和A379V 多態(tài)性與Lp-PLA2 活性的關(guān)系。隨著Lp-PLA2 基因多態(tài)性研究的不斷完善和深入，Lp-PLA2 多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)與老年CHD 的關(guān)系將會(huì)更加明確。

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