趙娜娜 洪梅 魯翔 嚴(yán)臘梅 周海波 賈志強(qiáng)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前嚴(yán)重危害老年人生命健康的最常見(jiàn)心血管疾病，研究證實(shí)炎癥在冠狀動(dòng)脈硬化發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，多種炎癥因子被證實(shí)參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［1-2］。脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)作為一種新型炎癥因子，與CHD 的發(fā)生密切相關(guān)。研究報(bào)道表明Lp-PLA2 的V279F、A379V、R92H和I198T 基因的多態(tài)性與CHD 的遺傳易感性具有相關(guān)性［3］，但是對(duì)于V279F 和A379V 基因多態(tài)性對(duì)CHD 的研究結(jié)論尚不一致，而且針對(duì)老年患者的研究較少見(jiàn)［4］，本文利用DNA 測(cè)序方法對(duì)中國(guó)老年漢族人群Lp-PLA2 基因多態(tài)性分布與CHD 遺傳易感性的相關(guān)性進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011 年2 月至2012 年3 月期間在我院心內(nèi)科住院的老年CHD 患者227 例，其中男119例，女108 例，年齡60 ～89 歲，平均(71.66 ±7.05)歲。對(duì)照組來(lái)源于本院健康體檢者101 例，其中男36例，女65 例，年齡60 ～88 歲，平均(66.94 ±6.57)歲。所有入組人員年齡≥60 歲，均行冠狀動(dòng)脈造影檢查，CHD 的診斷符合WHO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。以左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有1 支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%為有意義病變，或者患者有明確心肌梗死病史。所有患者均除外腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、慢性肝腎功能不全等系統(tǒng)性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 監(jiān)測(cè)指標(biāo):記錄患者既往疾病史及吸煙史。空腹12 h 取靜脈血2 ml，用德國(guó)ROCHE 公司P800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生物化學(xué)指標(biāo)。

1.2.2 外周血白細(xì)胞DNA 的制備:取EDTA 抗凝的靜脈血200 μl，用美國(guó)Invitrogen 公司提供的基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，TE 溶解保存于－20 ℃冰箱中。

1.2.3 Lp-PLA2 基因V279F 和A379V 位點(diǎn)的基因型檢測(cè):Platinum?Taq DNA 聚合酶，定制引物均由美國(guó)Invitrogen 公司提供，V279F 引物序列包括上游引物:5'-TCCAGTGTGGGTGACTACAAA-3'，下游引物 5'-TATGGGGGCAAAAGAATAGC-3';A379V 引物序列包括上游引物:5'-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3'，下游引物5'-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3'。待測(cè)樣品PCR 完畢，1.5% 的瓊脂糖膠鑒定，使用3730XL 型DNA 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SHEsis 軟件分析2 組的Hardy-Weinberg 平衡，組間基因型和等位基因頻率用Fisher's 精確概率檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用非條件logistic 逐步回歸模型分析CHD 主要危險(xiǎn)因素，以比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 CHD 組與對(duì)照組在高血壓、TG 水平等方面的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而CHD 組的年齡、吸煙比例和糖尿病比例明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，血清TC、HDL-C 及LDL-C 水平則明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2 組基本資料比較

2.2 V279F 和A379V 基因型分布和等位基因頻率的比較 V279F 有VV 型、VF 型和FF 型3 種基因型，A379V 包括AA 型、AV 型和VV 型3 種基因型。CHD組與對(duì)照組之間V279F 和A379V 基因型的分布及等位基因頻率:V279F 和A379V 在CHD 組和對(duì)照組之間的分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，V279F和A379V 基因型和等位基因的頻率在CHD 組和對(duì)照組之間分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CHD 組的亞組分析:V279F 和A379V 的基因型和等位基因的頻率在心肌梗死組和非心肌梗死組的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2，3。

表2 V279F 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

表3 A379V 基因型的分布及等位基因頻率(n，%)

2.3 單倍型分析 單倍型分析顯示FA、FV、VA、VV 4 種單倍型在CHD 組和對(duì)照組分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表4。

表4 V279F 和A379V 的單倍型分析

2.4 CHD 主要危險(xiǎn)因素的logistic 回歸分析 以是否為CHD 作為因變量，年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、TG、V279F、A379V 為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，在校正傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素后，未發(fā)現(xiàn)V279F 和A379V變異使患者患CHD 的風(fēng)險(xiǎn)增加。

3 討論

Lp-PLA2 又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，是磷脂酶超家族中的一員，主要由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成分泌，以多種亞型分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，Lp-PLA2 屬于非鈣離子依賴型，能夠催化甘油磷脂第2 位酰基酯鍵水解，在血液循環(huán)中主要與脂蛋白顆粒結(jié)合存在，絕大部分與低密度脂蛋白結(jié)合，少量與高密度脂蛋白及極低密度脂蛋白結(jié)合［5-6］。研究證實(shí)Lp-PLA2 的促動(dòng)脈粥樣硬化的作用通過(guò)多種細(xì)胞途徑完成，與CHD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是獨(dú)立于傳統(tǒng)心血管危險(xiǎn)因素的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［7-8］。Guerra 等［9］研究表明LP-PLA2 活性62%受遺傳因素的影響，編碼Lp-PLA2 的基因位于第6 號(hào)染色體p21.2-p12，包含12個(gè)外顯子。在Lp-PLA2 基因多態(tài)性與CHD 相關(guān)性研究方面，日本研究者首先報(bào)道了9 號(hào)外顯子上V279F的變異對(duì)Lp-PLA2 活性的影響，該位點(diǎn)的錯(cuò)義突變使纈氨酸變?yōu)楸奖彼?，雜合突變可使酶活性下降，少數(shù)的純合突變甚至使酶失去活性，增加了日本人口心肌梗死和腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的遺傳因素之一［10］。Liu 等［11］對(duì)臺(tái)灣人群的研究發(fā)現(xiàn)V279F變異與CHD 心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯相關(guān)性，Hou等［12］對(duì)中國(guó)漢族人群的研究同樣未發(fā)現(xiàn)V279F 變異能夠增加CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而韓國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)V279F變異可降低CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［13］。隨后Li 等［14］的研究卻發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族人群的V279F 的突變與CHD 是具有相關(guān)性的，之后更多研究發(fā)現(xiàn)V279F 變異只存在于亞洲人種，并未在高加索人中發(fā)現(xiàn)，而且研究結(jié)果尚有矛盾，結(jié)論不一。此外，早期的Kruse 等［15］研究表明了11 號(hào)外顯子上A379V 的變異降低了Lp-PLA2 與底物親和力，在高加索人過(guò)敏癥和哮喘的發(fā)生中可能起著關(guān)鍵作用。而后Ninio 等［16］研究發(fā)現(xiàn)CHD 組A379V 的379V 等位基因的頻率明顯低于對(duì)照組，提出379V 等位基因攜帶者對(duì)心血管有保護(hù)作用，可能降低CHD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Li 等［14］的研究也同時(shí)指出該A379V 基因突變?cè)黾恿诵募」Ｋ赖娘L(fēng)險(xiǎn)。杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究［4］指出A379V 的突變，可導(dǎo)致Lp-PLA2與底物親和力的降低，與CHD 具有相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)在漢族老年人口中，CHD 組V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與對(duì)照組無(wú)明顯差異，心肌梗死組與非心肌梗死組間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步進(jìn)行單體型分析未能發(fā)現(xiàn)與CHD 發(fā)病相關(guān)的單體型。在校正傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后進(jìn)行的logistic 回歸分析也未能發(fā)現(xiàn)與CHD 相關(guān)的基因型和等位基因。在本研究中出現(xiàn)了CHD 組的血清TC、HDL-C 以及LDL-C 水平明顯低于對(duì)照組的情況，考慮由于絕大多數(shù)CHD 患者在入院前已經(jīng)服用調(diào)脂藥物治療，導(dǎo)致血脂水平降低。由于本研究總體樣本量較少，在進(jìn)行入組篩選時(shí)將左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈及其主要分支中至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%納入CHD組，而對(duì)照組中尚存在一部分有冠脈粥樣硬化病變的患者，從而可能輕度導(dǎo)致V279F 和A379V 的基因型和等位基因頻率與CHD 組無(wú)明顯差異，在加大樣本量以及分組標(biāo)準(zhǔn)更加細(xì)致化的時(shí)候可能會(huì)避免上述問(wèn)題，使最后結(jié)果更有意義。

總之，對(duì)中國(guó)老年漢族人群的Lp-PLA2 基因多態(tài)性的研究，與國(guó)內(nèi)的一些研究結(jié)果基本一致，但由于實(shí)驗(yàn)條件所限未能定量定性檢測(cè)Lp-PLA2 的活性，未能更加明了直觀地分析V279F 和A379V 多態(tài)性與Lp-PLA2 活性的關(guān)系。隨著Lp-PLA2 基因多態(tài)性研究的不斷完善和深入，Lp-PLA2 多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)與老年CHD 的關(guān)系將會(huì)更加明確。

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