肖功年，李言郡，陳 波，林玲玲，尤玉如

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；3.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州310018）

圖1 花色苷結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of anthocyanidin

紫葡萄皮中含有大量糖苷，為花色苷配基花青素（anthocyanidin）［1－2］，是苯丙吡喃（phenotyrilium）的衍生物，有黃酮的C6C3C6結(jié)構(gòu)（圖1）［3］，具有陽離子的性質(zhì)。葡萄中的花色苷主要為矢車菊素、飛燕草素、錦葵色素、甲基花青素及矮牽牛苷配基（petunidin）5種花色素誘導(dǎo)體［4－5］。據(jù)報(bào)道，花色苷具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗氧化、抗腫瘤、延緩血小板凝集等營養(yǎng)和藥理作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力［6］。但花色苷通常不太穩(wěn)定，在葡萄中主要以糖苷形式（即花色苷）存在。紫葡萄皮中糖苷提取較難，而超聲波提取不改變有效成分的結(jié)構(gòu)，并且縮短了提取時(shí)間，提高得率，為植物成分的提取提供了快速、高產(chǎn)的新方法［7－9］。影響超聲波提取工藝的因素較多［10－11］，本試驗(yàn)以紫葡萄皮為原料，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法（response surface design，RSD），對超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲頻率等因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高超聲輔助萃取紫葡萄皮花色苷產(chǎn)率，為紫葡萄皮及花色苷的綜合利用和產(chǎn)品開發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紫葡萄，購自杭州市農(nóng)貿(mào)市場，無水甲醇、濃鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉均為分析純試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超聲波藥品處理機(jī)（JBT/C－YCL400T/3P（D）），離心機(jī)（KQ3200B），紫外可見分光光度計(jì)（UV－7504C），溫度計(jì)，容量瓶，三口燒瓶，量筒，玻璃棒，藥匙，鐵架臺，移液管，滴定管等。

1.3 RSD優(yōu)化提取超聲工藝設(shè)計(jì)

在前期研究基礎(chǔ)上，確定超聲波的功率（額定功率，154～286W）、溫度（30～50℃）、頻率（25～70kHz）和時(shí)間（25～45min）對紫葡萄皮花色苷的提取影響較大。以70%乙醇為萃取溶劑，應(yīng)用Box－Behnken中心組合進(jìn)行四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（取α＝2），見表1。以花色苷的吸光值為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化葡萄皮花色苷超聲波提取條件。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4 花色苷的測定

采用pH示差法測定花色苷總量［11］。確定兩個對花色苷吸光度差別最大但使花色苷穩(wěn)定的pH值，因葡萄皮花青素在pH1.0和pH4.5處的吸光值差是極大［12］，故選定pH1.0和pH4.5兩個pH值測定花色苷的吸光值。

將提取液分別用兩組緩沖溶液稀釋10倍，靜置2h，測定其在520nm和700nm處的吸光值。

pH4.5的緩沖液V（1NNaAc）∶V（1NHC1）∶V（H2O）＝100∶60∶90；

pH1.0的緩沖液V（0.2NKCl）∶V（0.2NHCl）＝25∶67。

花色苷吸光值＝（Aλ520pH1.0－Aλ700pH1.0）－（Aλ520pH4.5－Aλ700pH4.5）

根據(jù) T.Fuleki［12］的研究，計(jì)算方法如下：

式中：ΔA＝ （A520－A700）pH1.0－ （A520－A700）pH4.5；V— 花色苷溶液體積，mL；F— 稀釋倍數(shù)；avE1%1cm—平均消光系數(shù)，98.2［13］；m— 鮮葡萄皮質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對四因素進(jìn)行二次回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析，吸光值為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)采用Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results of experiments

經(jīng)Minitab軟件回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因子響應(yīng)值的影響可用上述四元三次回歸方程表示。從表3中可以看出，用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性、平方及交互作用關(guān)系都是顯著的，R－Sq＝96.23%，模型的響應(yīng)值的變化有96.23%來自所選因子，即超聲功率、超聲溫度、超聲頻率、超聲時(shí)間4個因素可以很好地解釋模型變化。

根據(jù)回歸方程，可以利用Minitab軟件繪出曲面圖和等值線圖，見圖2至圖7。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)其余變量保持在最佳水平。由響應(yīng)面圖可以看出所選因子對花色苷提取的相關(guān)性。從圖中還可以看出，超聲功率及其平方項(xiàng)，超聲溫度、超聲頻率的平方項(xiàng)及超聲功率與超聲時(shí)間的交互項(xiàng)對花色苷提取極顯著，各單因素對花色苷提取的影響依次為超聲功率＞超聲時(shí)間＞超聲溫度＞超聲頻率。

表3 回歸分析Table 3 Analysis of regression

圖2 Y＝f（A，B）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.2 Response surface and contour results of Y＝f（A，B）

圖3 Y＝f（A，C）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.3 Response surface and contour results of Y＝f（A，C）

圖4 Y＝f（A，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.4 Response surface and contour results of Y＝f（A，D）

圖5 Y＝f（B，C）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.5 Response surface and contour results of Y＝f（B，C）

圖6 Y＝f（B，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.6 Response surface and contour results of Y＝f（B，D）

圖7 Y＝f（C，D）的響應(yīng)曲面圖及等值線圖Fig.7 Response surface and contour results of Y＝f（C，D）

根據(jù)Minitab的響應(yīng)優(yōu)化器分析可以得圖8，由復(fù)合意合性可知設(shè)置能夠?yàn)樗许憫?yīng)獲得一個較好的結(jié)果，即評定總得分的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲功率286W，超聲溫度為45.2℃，超聲頻率為48.8kHz，超聲時(shí)間為45min。理論花色苷的得率為0.248 8g/100g。

圖8 最優(yōu)水平分析Fig.8 Analysis of optimal level

實(shí)驗(yàn)中采用超聲波功率286W，超聲溫度45℃，超聲頻率45kHz，超聲時(shí)間為45min，萃取紫葡萄皮花色苷，得率為0.235g/100g。

3 結(jié) 語

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析得出，紫葡萄最優(yōu)提取工藝為超聲功率286W，超聲溫度為45.2℃，超聲頻率為48.8kHz，超聲時(shí)間為45min，花色苷得率為0.235g/100g。

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