江仲超

吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林長春 130021

將與治療有關(guān)的細(xì)胞、干細(xì)胞接種于特定性能的三維生物支架材料上增殖培養(yǎng)后移植到體內(nèi)受損組織處來修復(fù)受損的組織[1]，這就是組織工程。原位成膠塑型隨意、操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小是可注射水凝膠的優(yōu)點(diǎn)，因此受到人們的關(guān)注。生物相容性良好，無免疫原性和可生物降解吸收等優(yōu)良性能是水凝膠生物支架被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)與臨床領(lǐng)域[2]的原因。研究表明物理水凝膠可制成一種可注射性支架，在室溫下為液態(tài)，注射到體內(nèi)時(shí)會(huì)變?yōu)槟z。本實(shí)驗(yàn)將制備骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與水凝膠復(fù)合體，并檢測(cè)細(xì)胞存活情況及其生物相溶性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑DMEM 培養(yǎng)基；胎牛血清、胰蛋白酶；MTT試劑，DMSO試劑。

1.1.2儀器倒置相差顯微鏡（Olympus）、CO2孵箱（BB16UV）、臺(tái)式高速離心機(jī)[T GL-16G（B）]、超凈工作臺(tái)，DG5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.1.3動(dòng)物日本大耳白兔(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 方法

1.2.1兔BMSCs的體外分離培養(yǎng)取3周日本大耳白兔，雌雄不拘。耳緣靜脈空氣栓塞處死后置于75%酒精浸泡約5~10 min，無菌條件下取股骨、脛骨，注射器吸取20 mL PBS沖洗髓腔兩遍，沖洗液離心棄掉含有脂肪的液體，達(dá)到初步純化，后用培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶中，飽和濕度37℃在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后半量換液，將未貼壁的細(xì)胞全部棄掉，以后每周換液2次。細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)，胰酶消化，10%胎牛血清L-DMEM終止消化，離心制成懸液，105/mL傳代。

1.2.2 PLGA-PEG水凝膠的制備每個(gè)青霉素小瓶中稱取PLGAPEG粉末0.5 g，密封好紫外燈照射滅菌20 min于超凈臺(tái)中在每小瓶材料中加入培養(yǎng)液1.5 mL密封后置于4℃冰箱保存。

1.2.3 BBMSCs與水凝膠復(fù)合物制備取生長良好的第三代BBMSCs進(jìn)行消化，1500 rpm離心10 min，細(xì)胞沉淀，以1 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)約為106個(gè)，在5 mL離心管中加入水凝膠溶液0.5 mL，細(xì)胞懸液0.5 mL，充分混勻，密封離心管，置于4℃冰箱中保存。

1.2.4水凝膠的細(xì)胞相容性研究取生長良好的第三代BBMSCs，調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度, 使得細(xì)胞的個(gè)數(shù)為104個(gè)，將細(xì)胞接種到96孔板中。設(shè)置空白對(duì)照及陽性對(duì)照孔，放入培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)孔中加入180 μlPLGA-PEG溶液，濃度依次成倍遞減，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。實(shí)驗(yàn)孔每孔加入 MTT溶液20 μl，后繼續(xù)培養(yǎng)4 h；4 h后將孔中液體棄掉，每也加入200 μl DMSO，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量492 nm處細(xì)胞的 OD值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察多數(shù)為圓形。少數(shù)細(xì)胞在原代BMSCs培養(yǎng)4 h后即有貼壁生長，7天后全量換液可見細(xì)胞呈多角形、或長梭形散布于瓶底。下圖為原代細(xì)胞生長曲線（圖1）。

圖1 原代細(xì)胞生長曲線

2.2 水凝膠成膠時(shí)間

圖2 PLGA-PEG相圖

應(yīng)用試管倒置法測(cè)水凝膠成膠溫度，配制不同濃度的PLGA-PEG溶液，置于恒溫水浴中，從5℃開始，每10 min升高1℃，倒置試管30 s不流動(dòng)定義為成膠，測(cè)得成膠溫度30℃。下圖為 PLGAPEG相圖（圖2）。

2.3 水凝膠的生物相溶性

應(yīng)用MTT試驗(yàn)測(cè)定PLGA-PEG水凝膠的生物相溶性。將注有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞懸液而沒有加PLGA-PEG水凝膠的孔做為空白對(duì)照。將注有骨髓基質(zhì)干細(xì)胞懸液加PEI水凝膠的孔做為陽性對(duì)照。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的活性隨著PLGA-PEG的濃度增加而逐漸減低；陽性對(duì)照組也顯示出相似的趨勢(shì)，但是PLGA-PEG組細(xì)胞活性要高于陽性對(duì)照組。可知，PLGA-PEG水凝膠具有較低的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相溶性。

3 討論

作為一群存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell，BMSC）目前已成為應(yīng)用較廣泛的重要種子細(xì)胞之一[4]。因其具有較強(qiáng)的自我更新能力、多向分化潛能和可塑性能、細(xì)胞[3]BMSC取材方便、在體外培養(yǎng)體系中具有較強(qiáng)的增殖傳代能力，免疫活性低的諸多優(yōu)點(diǎn)。骨髓中BMSC的含量約占骨髓有核細(xì)胞的1/10萬，含量極低，難以滿足細(xì)胞工程的需求[5]。所以要應(yīng)用其中的BMSC，就必須將它從造血系細(xì)胞中分離出來。因此,要進(jìn)一步開展BMSC應(yīng)用研究的實(shí)驗(yàn)首先必須建立體外分離、純化和大量擴(kuò)增BMSC的方法，探索保持其增殖潛能的適宜培養(yǎng)條件。

室溫下為液態(tài)、體溫下成膠是PLGA-PEG水凝膠的獨(dú)特性質(zhì)，且與以往的 含有PEG水凝膠相比，具有更小的細(xì)胞毒性、更加良好的細(xì)胞相容性[6]。BMSCs在PLGA-PEG水凝膠表面生長的形態(tài)良好，數(shù)量多。通過MTT試驗(yàn)可見PLGA-PEG水凝膠具有良好的生物相容性。BMSCs能夠在水凝膠的內(nèi)部伸展和生長，可模擬生物體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，為細(xì)胞提供支持和固定等作用。本研究構(gòu)建出的PLGA-PEG水凝膠可為細(xì)胞提供支持和固定，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的溝通等作用。結(jié)構(gòu)及功能也與細(xì)胞外基質(zhì)相似，作組織工程用生物支架材料十分理想。

[1]TANZI M C，F(xiàn)ARE S.Adipose tissue engineering，state of the art，recent advances and innovative approaches[J].Expert Review of Medical Devices，2009，6（5）：533-551.

[2]Mortisen.D，Peroglio.M，Alini.M，et al.Biomacromolecules，2010，11：1261-1272.

[3]胡孝麗，陳士龍，羅志曉，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在口腔頜面組織修復(fù)中的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2009，25（5）：662-663.

[4]GnecchiM，MeloLG.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells:isolation expension characterization viral transduction and production of conditioned medium[J].Methods Mol Biol，2009，482：281-294.

[5]Sehuppan D，Koda M，Bauer M，et a1.Fibrosis of liver，pancreas andin-testine:conlrf lon mechanisms and clear targets[J].ActaGastroenterol Belg，2000，63（4）：366-370.

[6]Linyu，Zheng zhang，Jiandong ding.Biodegradability and Biocompatibility of Thermoreversible Hydrogels Formed from Mixing a Sol and precipitate of Block Copolymers in Water[J].Biomacromolecules，2010，11，2169-2178.