鄔艷波，蔡漢新，劉育瓊，鄧欣

(1.深圳市觀瀾人民醫(yī)院感染科，廣東深圳518110；2.深圳市龍華新區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所醫(yī)療機(jī)構(gòu)監(jiān)督科，廣東深圳518110；3.深圳市第三人民醫(yī)院肝病科，廣東深圳518112)

慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義

鄔艷波1，蔡漢新2，劉育瓊1，鄧欣3

(1.深圳市觀瀾人民醫(yī)院感染科，廣東深圳518110；2.深圳市龍華新區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所醫(yī)療機(jī)構(gòu)監(jiān)督科，廣東深圳518110；3.深圳市第三人民醫(yī)院肝病科，廣東深圳518112)

【摘要】目的探討自身抗體陽性慢性乙肝(CHB)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的特點(diǎn)。方法自身抗體陽性的CHB患者20例、自身抗體陰性的CHB 20例、自身免疫性肝炎15例。用斑點(diǎn)免疫層析法檢測(cè)其抗單鏈DNA抗體(ss-DNA)、抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體(ANA)、可提取核抗原抗體譜(ENA)、抗線粒體IgM抗體(AMA)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，并與20例正常人對(duì)照組的上述指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果自身抗體陽性CHB組CD4+CD25+T細(xì)胞較正常人無減低(P＞0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)；與自身抗體陽性CHB比較，自身抗體陰性CHB組CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞均顯著升高(P＜0.05)，而自身免疫性肝炎情況則相反。結(jié)論自身抗體陽性CHB患者Treg細(xì)胞功能較正常人顯著降低，而且比自身抗體陰性CHB患者的Treg細(xì)胞數(shù)量及功能均偏低。這可能是自身抗體陽性CHB病情較重、反復(fù)發(fā)作的原因之一。

【關(guān)鍵詞】自身抗體；慢性乙型肝炎；CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)除肝臟免疫病理損傷外[1]，也可導(dǎo)致肝外自身免疫現(xiàn)象[2]。伴有自身抗體陽性的慢性乙肝臨床病情較重，易于復(fù)發(fā)，治療棘手。自身抗體陽性CHB的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不很清楚。近來發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)與CHB的發(fā)病有一定關(guān)系[3-4]。我們測(cè)定了20例自身抗體陽性慢乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，探討Treg細(xì)胞在自身抗體陽性慢乙肝發(fā)病中的意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2011年8月至2012年7月觀瀾人民醫(yī)院和深圳市第三人民醫(yī)院門診和住院的患者共55例，其中男性36例，女性19例，平均年齡38.1歲。所選CHB患者診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他肝炎病毒感染、重型肝炎、肝硬化失代償。根據(jù)慢性乙肝患者有無自身抗體陽性(抗單鏈DNA抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗核抗體、抗可提取核抗原抗體譜、抗線粒體IgM抗體5項(xiàng)自身抗體中1項(xiàng)以上陽性者，為自身抗體陽性CHB，陰性者為自身抗體陰性CHB)分為自身抗體陽性的CHB、自身抗體陰性的CHB。自身免疫性肝炎(AIH)患者的診斷符合2002年美國(guó)肝臟病學(xué)會(huì)自身免疫性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。55例患者中依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)分為自身抗體陽性CHB 20例、自身抗體陰性CHB 20例、自身免疫性肝炎15例。選取同期本單位健康工作人員20例為對(duì)照組，其中男性14例，女性6例，平均年齡32.5歲。

1.2主要儀器和試劑

1.2.1儀器流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司FACSCalibur。全自動(dòng)生化分析儀為OLYMPUS公司AU2700。

1.2.2試劑PC標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體和FITC標(biāo)記的抗CD25抗體購自美國(guó)BD公司；PE標(biāo)記的抗Foxp3抗體、細(xì)胞固定/破膜液及稀釋液、緩沖液購自eBiolsciense公司，淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?，流式?xì)胞儀(EPICS XL)為美國(guó)貝克曼-庫爾特公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1自身抗體檢測(cè)抗單鏈DNA抗體(ss-DNA)、抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體(ANA)、可提取核抗原抗體譜(ENA)、抗線粒體IgM抗體(AMA)檢測(cè)均采用斑點(diǎn)免疫層析法，均按試劑盒說明進(jìn)行操作，由本院檢驗(yàn)科完成。

1.3.2外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞及Foxp3+細(xì)胞比例檢測(cè)所有被觀察對(duì)象均于清晨空腹采集靜脈血2 ml，EDTA抗凝，用PBS1：1稀釋后，以淋巴分離液分離，獲得單個(gè)核細(xì)胞。計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107/ml，取100 μl(1×106個(gè))PBMC分別加入PC-抗CD4、FITC-抗CD25抗體各20 μl，混勻，室溫避。光孵育15 min，加入冷PBS洗滌1次，離心5 min，棄上清，加入新鮮配制的固定/破膜液1 ml，4℃避光反應(yīng)30～60 min，用固定/破膜緩沖液2 ml洗滌2次，加入PE-抗Foxp3抗體20 μl，4℃避光作用30 min，用固定/破膜緩沖液2 ml洗滌2次，棄上清，加入0.5 ml PBS，混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用CellQuest軟件分析。以CD4+細(xì)胞和SSC門，選擇CD4+細(xì)胞分析CD25和Foxp3表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。四組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1自身抗體陽性CHB患者自身抗體分布情況20例CHB患者中，ss-DN 6例，ds-DNA 6例，ANA5例，ENA2例，AMA1例。

2.2各組患者外周血PBMC中CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)的比較與正常對(duì)照組比較，自身抗體陰性CHB組CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)無增加；自身免疫性肝炎組CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞均顯著降低(P＜0.05)；自身抗體陽性CHB組CD4+CD25+T細(xì)胞無減低(P＞0.05)，但CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞顯著降低(P＜0.05)，提示自身抗體陽性CHB患者Treg細(xì)胞功能顯著降低。與自身抗體陽性CHB組比較，自身免疫性肝炎組CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)顯著降低(P＜0.05)，自身抗體陰性CHB組CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞均顯著升高(P＜0.05)，提示自身抗體陰性CHB的Treg細(xì)胞數(shù)量及功能均偏高，見表1。

表1　各組外周血CD4＋CD25＋T細(xì)胞和CD4＋CD25＋FoxP3＋細(xì)胞比較(%，)

表1　各組外周血CD4＋CD25＋T細(xì)胞和CD4＋CD25＋FoxP3＋細(xì)胞比較(%，)

注：a與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；b與自身抗體陽性CHB組比較，P＜0.05。

組別自身抗體陽性CHB組自身抗體陰性CHB組自身免疫性肝炎組正常對(duì)照組例數(shù)20 20 15 20 CD4+CD25+T細(xì)胞5.66±2.21 8.56±3.72ab3.38±1.65ab6.93±2.83 CD4+CD25+Foxp3+21.28±2.47a29.16±5.32b19.37±2.53a27.87±4.36b

3　討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)具有免疫抑制性和免疫無能性，其主要表現(xiàn)在CD4+CD25+Tregs經(jīng)TCR刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖。CD4+CD25+Tregs被活化后，其抑制作用即為非抗原特異性的，不具有MHC限制性。目前一般認(rèn)為CD4+CD25+Tregs的作用機(jī)制有以下3種：①體外通過細(xì)胞間接觸依賴機(jī)制發(fā)揮作用。CD4+CD25+Tregs可通過CTLA-4、TGF-β及GITR等與靶細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，并抑制靶細(xì)胞上IL-2Rα鏈的表達(dá)，降低靶細(xì)胞對(duì)IL-2的反應(yīng)性從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖[5]。②體內(nèi)調(diào)節(jié)功能主要依靠抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、IL-4及TGF-β。③CD4+CD25+Tregs還可通過與抗原提呈細(xì)胞的作用來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。研究表明活化后的CD4+CD25+Tregs可表達(dá)顆粒酶A，在細(xì)胞直接接觸基礎(chǔ)上，通過穿孔素依賴的細(xì)胞毒作用殺傷多種自體靶細(xì)胞[6]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄抑制因子Fox P3被認(rèn)為是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育及啟動(dòng)抑制功能的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平能更為精確地反映CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活性[7]。多數(shù)研究提示[8]： CHB患者體內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量或者功能異常，降低了機(jī)體的HBV特異性的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，使得HBV不能得到徹底清除，反復(fù)感染。然而，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在自身免疫性肝炎中的情況與慢性乙型肝炎中完全相反[9]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下降可能是自身免疫性肝炎發(fā)病的原因之一。CHB患者存在血清自身抗體陽性的自身免疫現(xiàn)象，因此我們研究了自身抗體陽性慢乙肝患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果表明，自身抗體陽性CHB患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能較正常人顯著降低，而且比自身抗體陰性CHB患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及功能均偏低，這可能是自身抗體陽性CHB病情較重，反復(fù)發(fā)作的原因之一。

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【中圖分類號(hào)】R512.6+2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1003—6350（2013）19—2872—03

doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2013.19.1197

(收稿日期：2012-12-26)

基金項(xiàng)目：深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：20110704)

通訊作者：鄔艷波。E-mail：wuyanbo1969@sina.com

Detection and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B.

WU Yan-bo1,CAI Han-xin2,LIU Yu-qiong1,Den Xing3.1.Department of Infection,Shenzhen Guanlan People's Hospital,Shenzhen 518110,Guangdong,CHINA;2.Department of Medical Institution Supervision, Shenzhen Guanlan Health Supervision Institute,Shenzhen 518110,Guangdong,CHINA;3.Department of Hepatology, Shenzhen Third People's Hospital,Shenzhen 518112,Guangdong,CHINA

【Abstract】ObjectiveTo investigate the features of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell in patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B.MethodsTwenty patients with autoantibody-positive chronic hepatitis B (CHB),20 patients with autoantibody-negative CHB,and 15 patients with autoimmune hepatitis(AIH)were selected as research subjects,and 20 healthy people were taken as the control group.Anti-single-stranded DNA antibody (ss-DNA),anti-double-stranded DNA antibodies(ds-DNA),antinuclear antibody(ANA),extractable nuclear antigens antibody(ENA),anti-mitochondrial IgM antibodies(AMA)were detected by dot immuno-chromatography.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells were measured by using flow cytometry.ResultsCompared with healthy people,CD4+CD25+T cells of autoantibody-positive CHB patients showed no significant decrease(P＞0.05),while CD4+CD25+Foxp3+T cells reduced significantly(P＜0.05).In comparison with autoantibody-positive CHB patients,CD4+CD25+T cells and CD4+CD25+Foxp3+T cells in autoantibody-negative CHB patients increased significantly(P＜0.05),while those in patients with AIH were on the contrary.ConclusionRegulatory T cells of patients with autoantibody-positive CHB are significantly lower than healthy human.Furthermore,the number and function of regulatory T cell of patients with autoantibody-positive CHB are lower than those of autoantibody-negative CHB patients.This is probably one of the reasons why autoantibody-positive CHB patients are more severe and recurrent.

【Key words】Autoantibody;Chronic hepatitis B(CHB);CD4+CD25+Foxp3 regulatory T cell