楊姣英，張玉霞，蔣林時(shí)

（遼寧石油化工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院， 遼寧 撫順 113001）

隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油在開(kāi)采，運(yùn)輸，裝卸，加工和使用的過(guò)程中，由于泄露和排放，引起土壤的污染，造成土壤的鹽堿化，毒化和廢棄，甚至有毒物質(zhì)通過(guò)農(nóng)作物尤其地下水進(jìn)入食物鏈，最終直接危害人類(lèi)[1]。用物理方法治理土壤的石油污染的同時(shí)會(huì)破壞土壤的結(jié)構(gòu)和組分，而且價(jià)格昂貴不易實(shí)施。使用化學(xué)的方法又會(huì)造成二次污染[2]。因此，利用生物修復(fù)技術(shù)治理石油污染的土壤的方法日益受到人們的重視[3]。石油烴中，烷烴占 90%左右，直鏈烷烴大約占15%～30%，是主要的污染物。不同的石油降解菌對(duì)不同的烴類(lèi)分子的降解特性不同。本研究以正十二烷烴為唯一碳源，從遼河油田采油井附近被油污染的土壤中分離和篩選出一株可以高效降解烴類(lèi)的微生物，并通過(guò)對(duì)其形態(tài)和生理生化特性的研究，初步做出鑒定，并通過(guò)改變培養(yǎng)條件，提高其降解性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

采自遼河油田采油井附近長(zhǎng)期被油污染的土壤中。

1.1.2 培養(yǎng)基配置

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaH2PO40.2 g，(NH4)2SO40.1 g，無(wú)水 CaCl20.02 g，NaNO30.1 g，MgSO47H2O 0.04 g，K2HPO40.2 g，用蒸餾水定容至0.2 L，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨2.0 g，牛肉膏1.0 g，氯化鈉1.0 g，用蒸餾水定容至0.2 L，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。

固體培養(yǎng)基：各培養(yǎng)基中加入 1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂。pH為7.0，高溫濕熱滅菌，倒平板或制成試管斜面。

十二烷培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 120 ℃滅菌 20 min后加入正十二烷作為唯一碳源。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選分離及鑒定

取由40目篩篩過(guò)的土壤2.0g，放入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，并加入0.07 mL正十二烷(錐形瓶?jī)?nèi)正十二烷濃度為 500 mg/L)，放在溫度為35 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床里培養(yǎng)，每2 d接種一次，接種量為10%[4]，正十二烷濃度逐漸增加至1.0、1.5和2.0 g/L。當(dāng)十二烷的濃度增加到2.0 g/L后，以10%的接種量接種到十二烷培養(yǎng)基中，十二烷的濃度為2.0 g/L。馴化培養(yǎng)4 d。配置正十二烷的濃度為0.5 g/L的，采用平板稀釋法將馴化了4 d后的菌液涂布已配置好的無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基中，放到 35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)星期后，挑選出菌型比較良好的單菌落在含正十二烷濃度為0.5 g/L的富集平板培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化直到純菌種培養(yǎng)，保存菌種備用。

1.2.2 測(cè)定菌株的降解率

取純化后保存的菌種活化，按接種量為10%取活化后的菌液加入正十二烷的濃度為0.5 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，另取不接種的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。設(shè)定搖床的培養(yǎng)條件為溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，連續(xù)培養(yǎng)2 d。然后離心菌液（轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心20 min)，將上清液倒入錐形瓶中，先加入50%濃硫酸酸化，取適量的石油醚萃取2～3次，收集上層清液用無(wú)水硫酸鈉脫水、過(guò)濾、定容，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定內(nèi)正十二烷殘留量，并計(jì)算正十二烷的降解率[5]。

1.2.3 測(cè)定菌株的生長(zhǎng)量

取菌種活化，在不同的時(shí)間段用移液管移取錐形瓶中適量的菌液，在波長(zhǎng)600 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值(OD600)，用去離子水做空白實(shí)驗(yàn)，以濁度表示菌體的生長(zhǎng)量。

1.2.4 降解菌株的鑒定

通過(guò)觀察菌體形態(tài)，菌落特征及生理生化特性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]鑒定菌種。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌株的篩選分離及鑒定

經(jīng)過(guò)多次富集培養(yǎng)和篩選、分離與純化，得到一株具有降解十二烷能力的菌株，命名為SHY1。

SHY1菌菌落較大，表面光滑，金黃色，邊緣整齊的不規(guī)則短桿狀，有鞭毛。革蘭氏染色為陰性，具有硝酸鹽的反硝化作用，可以利用明膠，氧化酶陽(yáng)性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能利用淀粉，M.R反應(yīng)為陽(yáng)性，吲哚反應(yīng)為陰性V.P反應(yīng)為陰性，接觸酶實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。由以上生理生化特性推斷，SHY1菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株的影響

將菌株按10%接種量接種于含500 mg/L正十二烷的90 mL富集培養(yǎng)基中，35 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣。結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of cultivating time on the strain growth

在接種0～10 h，因菌種代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境，生長(zhǎng)量(以O(shè)D600表示，下同)較低，為延滯期；在10～28 h時(shí)，該曲線上升趨勢(shì)增大，菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；28～46 h，生長(zhǎng)曲線趨于平緩，因?yàn)殡S著微生物大代謝繁殖，菌液中的營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)，代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)大量積累，新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期；46 h后，生長(zhǎng)曲線開(kāi)始下降，單位時(shí)間內(nèi)菌液中的細(xì)胞死亡數(shù)多于新生的細(xì)胞數(shù)，菌體進(jìn)入衰敗期。從該生長(zhǎng)曲線上看，該菌適應(yīng)和調(diào)整的時(shí)間比較短暫，這表明該菌的繁殖速度較快，有較強(qiáng)的繁殖能力，同時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)際應(yīng)用較有利。

2.3 環(huán)境條件對(duì)正十二烷烴降解及菌株生長(zhǎng)影響

2.3.1 接種量的影響

控制接種量分別為5%，10%，15%，18%，20%。在35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌株生長(zhǎng)量和正十二烷降解率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)得到圖2。

圖2 接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)和正十二烷降解的影響Fig.2 Effect of inoculation on the growth of strain and degradation of dodecane

圖2表明，接種量為5%～10%時(shí)，正十二烷的降解率和菌株生物量隨接種量的增大而升高；當(dāng)接種量為10%時(shí)，降解率達(dá)到最大值；接種量為10%～18%時(shí)菌體的生長(zhǎng)量繼續(xù)上升，但是正十二烷的降解率反而開(kāi)始降低；接種量為18%～20%時(shí)菌體生長(zhǎng)量開(kāi)始降低，正十二烷的降解率繼續(xù)降低。接種量的大小會(huì)影響延滯期的長(zhǎng)短，接種量過(guò)小時(shí)，會(huì)使延滯期較長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)慢，從而影響正十二烷的降解率。但是，接種量過(guò)大則會(huì)使內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物的消耗加速，同時(shí)代謝產(chǎn)物積累過(guò)多，溶氧不足，毒性隨之增強(qiáng)[8]。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，實(shí)際操作時(shí)采用接種量為10%時(shí)為最佳。

2.3.2正十二烷濃度的影響

分別以濃度為 100，200，500，1 000，1 500和2 000 mg/L的正十二烷，按10%接種量接種，在35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌株生長(zhǎng)量和正十二烷降解率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)得到圖3。

圖3 正十二烷濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)和正十二烷降解的影響Fig.3 Effect of dodecane mass concentration on the growth of strain and degradation of dodecane

由圖3可見(jiàn)，正十二烷濃度為500 mg/L時(shí)，正十二烷降解率和菌株生長(zhǎng)量均較高，高于500 mg/L時(shí)，正十二烷降解率和菌體生長(zhǎng)量都會(huì)隨著濃度的增加而降低。因?yàn)殡S著正十二烷的濃度的增加，細(xì)菌數(shù)量大幅度增加，促進(jìn)了對(duì)正十二烷的生物降解；但當(dāng)正十二烷的濃度過(guò)大時(shí)，有可能阻礙了氧的傳遞，導(dǎo)致菌體不能良好生長(zhǎng)，從而使降解率下降。因此，適合接種SHY1菌的正十二烷的濃度為500 mg/L。

2.3.3 pH值的影響

控制這pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，向各瓶中加入濃度為500 mg/L(0.07 mL)的正十二烷，按10%接種量接種，在35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，測(cè)定菌株生長(zhǎng)量和正十二烷降解率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)得到圖4。

圖2-4表明：正十二烷的降解率在pH為4.0～8.0時(shí)，隨著pH的不斷增加而逐漸增大，在pH為8.0時(shí)降解率達(dá)到最大值，此后隨著pH的增加又逐漸減小。所以該菌株在pH為8.0的弱堿性條件下對(duì)正十二的降解率比較高。過(guò)高或過(guò)低的初始pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)和正十二烷的降解都不利于。

圖4 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)和正十二烷降解的影響Fig.4 Effect of initial pH on the growth of strain and degradation of dodecane

2.3.4 溫度的影響

濃度為500 mg/L(0.07ml)的正十二烷，按10%的接種量接種，分別在25, 30, 35, 37, 40 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h以后，測(cè)定菌株生長(zhǎng)量和正十二烷降解率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)得到圖5。

圖5 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和對(duì)正十二烷降解的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of strain and degradation of dodecane

圖2 -5表明：該菌種在溫度為30～37 ℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度有所增加，且在 37 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最高；溫度低于30 ℃或高于37 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到抑制，因此菌株的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。

3 結(jié) 論

(1) 通過(guò)對(duì)遼河油田采油井附近長(zhǎng)期被油污染的土壤進(jìn)行馴化、篩選和分離，得到一株能夠以正十二烷為唯一碳源進(jìn)行生物降解的正十二烷降解菌(SHY1菌)。經(jīng)鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas)。

(2) 通過(guò)生長(zhǎng)條件優(yōu)化得出，SHY1菌株的最適生長(zhǎng)條件是：培養(yǎng)基的初始pH=8.0，溫度為37 ℃，接種量為10%。

(3) 在最適的條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中正十二烷的含量為500 mg/L時(shí)，在72 h內(nèi)降解率可達(dá)65.2%。

［1］Tao Liu，F(xiàn)eng hua wang，Lan ping guo．Biodegradation ofn-hexadecane by bacterial strains B1and B2 isolated from petroleum-contaminated soil[J] . Science China Chemistry 2012，55(9)：1968-1975．

［2］鄧紹云，徐學(xué)義，邱清華．我國(guó)石油污染土壤修復(fù)研究現(xiàn)狀與展望[J].北方園藝，2012 (14)：184-190．

［3］李景全，肖盟，石布乾．生物強(qiáng)化技術(shù)在油田污水處理工程中的應(yīng)用[J].油田化學(xué)，2011，28（3）：338-341．

［4］向麗君，陳雙扣，余媛媛. 石油烴降解菌的篩選及其生長(zhǎng)條件研究[J].工業(yè)安全與環(huán)保，2012，38（7）：65-67．

［5］王國(guó)惠．環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2011：111-113．

［6］東秀珠，蔡妙英．常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：128-132．

［7］布坎南，吉本斯．伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1998：274-280．

［8］Michail M Yakimov，Kenneth N Timmis，Peter N Golyshin. Obligate oil-degrading marine bacteria [J].Current Opinion in Biotechnology，2007，18（3）：257-266．