王春民， 楊冬麗*， 鄭艷春， 張瑞華

(頸復康藥業(yè)集團有限公司，河北省中藥新輔料工程技術研究中心，河北承德067000)

頸復康制劑揮發(fā)油的提取方法是將含有揮發(fā)油的藥材川芎、蒼術、羌活、乳香、沒藥按處方比例混合后用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。其中川芎揮發(fā)油中所含川芎內酯類化合物對微血管具有解痙、增加毛細血管開放數目、加快血流速度的作用［1-2］。Z-藁本內酯和洋川芎內酯A是川芎內酯類化合物中質量分數較高的2種成分［3］，對發(fā)揮頸復康制劑活血通絡的功效起到了重要作用。研究表明川芎與其它藥材混合不利于Z-藁本內酯的提取，且隨著混合藥材種類的增加，藁本內酯提取率下降［4］。為此，開展對頸復康制劑揮發(fā)油的提取工藝研究，提高川芎內酯類的轉移率，較大限度的保留有效成分，提高藥品療效。本研究分別以Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素為指標考察二次蒸餾-萃取耦合法和傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法兩種提取方法對頸復康制劑揮發(fā)油提取效率的影響。

1 儀器與試藥

Agilent7890A氣相色譜儀，Agilent G4513A自動進樣器，HP-530 m×0.32 mm石英毛細管柱 (Agilent公司)，蒼術素對照品 (中國食品藥品檢定研究院，111924-201102)，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A對照品 (上海順勃生物工程有限公司，純度≥98%)，無水乙醇 (天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)。川芎 (chuanxiong rhizoma，批號 100102)、蒼術 (atractylodis rhizoma，批號100401)、羌 活 (NotopterygiiRhizoma etradix，批 號100504)、乳香 (Bosewlliacarte，批 號 100301)、沒 藥(commiphora(Nees)Engl，批號100101)均由頸復康藥業(yè)集團有限公司提供，經王春民主任中藥師鑒定。

2 方法與結果

2.1 分析方法

2.1.1 揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的測定方法在文獻［5］研究基礎上，將測定方法確定為:采用HP-530 m×0.32 mm石英毛細管柱，FID檢測器，檢測器溫度250℃，脈沖不分流，程序升溫，初始溫度110℃，以1.5℃/min升溫至155℃，再以20℃/min升溫至250℃，保持3 min。載氣氮氣，進樣量2 μL。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品適量，用無水乙醇配成質量濃度分別為0.2、0.2、0.4 mg/mL的溶液，分別精密吸取Z-藁本內酯對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL;洋川芎內酯A對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL;蒼術素對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1 mL置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進樣檢測。分別以Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的峰面積為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程分別為 Z-藁本內酯 Y=1047.3 X－6.326，r=0.9996;洋川芎內酯 A Y=1058.7 X－1.4251，r=0.9999;蒼術素Y=1011.3X－1.8131，r=0.9997線性范圍分別為 11.24 ～112.4 μg/mL;1.638 ～16.38 μg/mL;4.172 ～41.72 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取頸復康制劑揮發(fā)油1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，即得。

2.1.4 對照品溶液的制備 取Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品適量，精密稱定，用無水乙醇分別配成質量濃度為25、5、16 μg/mL的溶液。見圖1。

圖1 對照品A和樣品B揮發(fā)油GC圖譜

2.1.5 儀器精密度 取同一供試品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，計算 RSD分別為1.03%、1.11%、0.86%(n=6)，精密度符合要求。

2.1.6 重復性試驗 取同一批次提得的揮發(fā)油，按供試品溶液的制備方法，重復處理6份，測定，計算含量，RSD分別為1.22%、1.41%、1.37%(n=6)，重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h測定峰面積，計算峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.97%。試驗結果表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的揮發(fā)油0.5 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，至10 mL量瓶中，精密加入適量Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，在上述色譜條件下，進樣測定，計算平均回收率分別為99.6%、101.4%、100.5%，RSD分別為1.46%、1.37%、1.82%，(n=6)。

2.2 頸復康制劑揮發(fā)油的提取工藝研究

2.2.1 傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法 按處方比例取蒼術、川芎、羌活、乳香、沒藥，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取6 h，GC法檢測揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的含量，計算轉移率。結果見表2。

2.2.2 二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復康制劑揮發(fā)油 按處方比例取除川芎外的其余四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油Ⅰ，備用;另取川芎藥材加6倍量水，并于揮發(fā)油提取器中加入一定量揮發(fā)油Ⅰ，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，得揮發(fā)油II，合并揮發(fā)油Ⅰ和揮發(fā)油Ⅱ，GC法檢測。

2.2.2.1 考察不同揮發(fā)油提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響 按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取四味藥材揮發(fā)油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，于揮發(fā)油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，提取時間分別為4 h、6 h、8 h。分別合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油后，混勻，GC法檢測，計算揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率，考察不同提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響。結果見表1。

表1 提取時間對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率的影響

研究表明，提取時間在4～6 h時，隨著提取時間的延長，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率呈逐漸增加的趨勢;當提取時間達到8 h后，Z-藁本內酯的轉移率不再有明顯增加，而洋川芎內酯A的轉移率稍低于提取6 h的結果。因此，將提取時間確定為提取6 h。

2.2.2.2 不同揮發(fā)油萃取量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響 按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，分別于揮發(fā)油提取器中加入0.1、0.2、0.3 mL已提得的四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油。合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油后，混勻，GC法檢測，計算混合后揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的轉移率，考察四味藥材揮發(fā)油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響。結果見表2。

2.2.2.3 二次蒸餾-萃取耦合法提取工藝的確定 由實驗結果可知，四味藥材揮發(fā)油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響較小，因此，考慮到實驗的可操作性和準確性，將四味藥材揮發(fā)油的加入量確定為0.2 mL。確定提取工藝為:按處方比例取蒼術、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油6 h，備用。另取川芎藥材加6倍量水，于揮發(fā)油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油6 h，合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油，混勻。GC法檢測混合后揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素的轉移率，結果見表2。

表2 不同提取方法中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率

由表中數據可以看出，四味藥材揮發(fā)油的加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A、蒼術素轉移率的影響較小。

與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復康制劑揮發(fā)油，Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對蒼術素的轉移率沒有明顯影響。

為進一步確定上述揮發(fā)油提取工藝的合理性，分別用兩種方法提得的頸復康制劑揮發(fā)油展開對小鼠鎮(zhèn)痛與活血作用的藥理學研究，結果顯示經二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復康制劑揮發(fā)油與水蒸氣蒸餾法提得的揮發(fā)油相比鎮(zhèn)痛與活血作用增強，具體內容將另文發(fā)表。

3 討論

研究表明采用二次蒸餾-萃取耦合法提取的頸復康制劑揮發(fā)油中Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對蒼術素的轉移率沒有明顯影響。進一步證明川芎與其它藥材混合不利于內酯類成分的提取。

不同揮發(fā)油加入量對Z-藁本內酯、洋川芎內酯A轉移率無顯著影響，考慮到用于萃取的揮發(fā)油加入量太少會產生黏壁現象，因此，在進行研究時，加入0.2 mL。

本研究曾采用水蒸氣蒸餾法單獨對川芎藥材進行揮發(fā)油提取，隨著提取時間的延長，在提取過程中容易出現揮發(fā)油上下分層的現象，下層揮發(fā)油會逐漸隨著冷凝水流回至提取容器中，導致提取率大大降低，采用二次蒸餾-萃取耦合法提取時避免了分層現象的出現。分析原因可能是由于相似相溶的原理，使川芎揮發(fā)油分子更易聚集于極性相似的揮發(fā)油分子中而遠離極性較強的水中。

采用二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復康制劑中的揮發(fā)油避免了單獨提取川芎揮發(fā)油時容易分層的現象，提高了Z-藁本內酯、洋川芎內酯A的轉移率的同時保持了其它揮發(fā)油成分轉移率。采用頸復康制劑的其它四味藥材揮發(fā)油作為萃取溶劑，最大限度的保留了有效成分的同時，避免了其它溶劑與成分的引入，該方法用于頸復康制劑中揮發(fā)油的提取更為合理。中藥揮發(fā)油成分復雜，尤其是多種藥材揮發(fā)油混合提取時，不同成分存在相互影響，因此提取工藝的確定值得研究。

［1］張 延.川芎藥效成分對照品的制備和定量分析方法的研究［D］.天津大學，2007.

［2］石力夫，鄭曉梅，秦 溱，等.Z-藁本內酯分解前后川芎揮發(fā)油對兔球結膜微循環(huán)影響的比較［J］.中國藥理學與毒理學雜志，1995，9(2):157.

［3］孫廣平.川芎內酯類成分制備工藝與分析方法［D］.天津大學，2006.

［4］張立國，張 超，王春民，等.混合提取對頸復康制劑中川芎揮發(fā)油提取率的影響［J］.中成藥.2011，33(9)1620-1622.

［5］王春民，楊冬麗，鄭艷春，等.頸復康顆粒原藥材配伍所含揮發(fā)油中Z-藁本內酯和洋川芎內酯A的測定［J］.中草藥，2012，43(7):1344-1346.