彭 菲， 葉正良， 李德坤， 孫建強(qiáng)， 王 斌

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300410;3.默克化工(上海)技術(shù)有限公司，上海201203)

人參Panax ginseng C.A，Mey.為五加科物的植物，是珍貴的中藥材，在我國藥用歷史悠久。人參皂苷被認(rèn)為是人參的主要活性成分，根據(jù)皂苷元的不同，人參皂苷被分為原人參二醇類皂苷、原人參三醇類皂苷及齊墩果酸類皂苷;其中原人參二醇類皂苷包括人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Rs1、Rs2等，原人參三醇類皂苷包括人參皂苷 Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、Rh3、Rf1等，不同人參皂苷其藥理活性表現(xiàn)多樣。現(xiàn)代研究認(rèn)為，人參具有免疫調(diào)節(jié)、消炎、提高機(jī)體抵抗力等作用。由于人參療效確切，其早已成為各種現(xiàn)代中藥制劑的重要處方組成［1－2］。

目前，超濾技術(shù)已經(jīng)在中藥產(chǎn)業(yè)得到廣泛的應(yīng)用［3－6］，超濾是以微孔濾膜為過濾介質(zhì)，在外界壓力作用下，使藥液流經(jīng)膜面，迫使小分子物質(zhì)透過膜，大分子被膜截留的一種分離方法，此方法操作簡便，無需外加化學(xué)藥劑且濾膜可以重復(fù)使用，因此在中藥產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用具有其獨特的作用和較大的開發(fā)潛力。但在實際操作中，由于中藥成分復(fù)雜，超濾膜的選擇(包括膜的材質(zhì)和孔徑等)對中藥超濾通量有重要的影響，因此在采用超濾工藝時需就具體品種進(jìn)行實驗考察其適用性。筆者在本實驗中研究不同孔徑及材質(zhì)的超濾膜對人參皂苷類成分的影響，用HPLC分析超濾前后得成分量的變化，比較不同材質(zhì)及孔徑的超濾膜對人參皂苷類成分透過率的適用性，為中藥制劑中超濾工藝的開發(fā)及優(yōu)化提供可參考的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 材料 人參總皂苷 (天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供);人參皂苷 Rg1、Re、Rb、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rf、Rg2、Rg3對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:111562—200605);甲醇，乙腈為色譜純;磷酸，氫氧化鈉為分析純;純化水，超純水自制。

1.2 儀器 Millipore LabscaleTMTFF System板框式超濾裝置，Millipore Pellicon XL Biomax50 30k/50k/100k 50cm2超濾膜，Millipore Pellicon 2 mini板框式超濾裝置，Millipore Easy－load蠕動泵，Millipore Pellicon 2 mini PLC 30k/100k 0.1m2超濾膜 (Masterflex I/P美國Millipore公司);AL204電子天平，XS105梅特勒精密電子分析天平 (上海梅特勒－托利多儀器上海有限公司);Waters2695高液相色譜儀;Waters2489檢測器;Waters symmetryR C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);水浴鍋。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品中皂苷的測定方法

2.1.1 色譜條件 waters symmetryR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm柱);乙腈為流動相A，以0.05%磷酸水溶液為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為203 nm，柱溫30℃，體積流量為1 mL/min;進(jìn)樣量為10μL。

2.1.2 人參皂苷對照品的制備 精密取人參皂苷Rg1、Re、 Rf、 Rb1、 Rg2、 Rc、 Rb2、 Rb3、 Rd、Rg3對照品適量，分別用甲醇制成10種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液作為人參皂苷對照品，其中各人參皂苷的含量分別如下:Rg1為0.209 6 mg/mL，Re為0.098 1 mg/mL，Rf為 0.092 5 mg/mL，Rb1為0.298 9 mg/mL，Rg2為 0.106 1 mg/mL，Rc為0.104 9 mg/mL，Rb2為 0.197 7 mg/mL，Rb3為0.068 9 mg/mL，Rd 為 0.1 001 mg/mL，Rg3為0.046 5 mg/mL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Grant program of mobile phase

2.1.3 含量測定 分別吸取人參皂苷對照品、超濾前對照液和超濾滲透液供試品各10μL，注入液相色譜儀，測定樣品中各單體皂苷的含量。

2.2 超濾原液的制備 稱取人參總皂苷原料適量，用水配置成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的藥液;經(jīng)0.45μm的親水系濾膜過濾后用于超濾實驗。

2.3 超濾條件

2.3.1 藥液的超濾及取樣 以20 L/m2(每平方米的超濾膜濾20升溶液)的量取超濾原液分別經(jīng)30、50、100 kDa的聚醚砜超濾膜及30 kDa、100 kDa的纖維素超濾膜進(jìn)行超濾，保持在一定超濾條件下 ［入口體積流量為5 L/(min·m2)］，超濾膜入口壓為207 kPa，回流口壓為68.9 kPa)，使原液(20℃)通過超濾膜;待樣品到達(dá)最小工作體積時，以10 L/m2的量進(jìn)行補(bǔ)水，繼續(xù)采用等體積透析法超濾直至原液池中溶液完全濾出，超濾結(jié)束;將滲透液加水定容后取樣。超濾結(jié)束后取濾前超濾原液和濾后超濾滲透液用于皂苷含量的測定。

2.3.2 超濾膜的清洗方法 每次超濾膜使用后應(yīng)立即進(jìn)行清洗，并采用濾膜清洗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對濾膜進(jìn)行清洗，其中清洗溶液有純化水和NaOH溶液。清洗后的超濾膜在濾膜完整性測試顯示完好后可直接用于下次試驗。

2.3.3 超濾前后皂苷含有量的對比 根據(jù)各濾前和濾后樣品皂苷含有量的測定結(jié)果計算各單體皂苷的超濾透過率。

單體皂苷A的透過率 (RA)=(滲透液中A的含量×滲透液體積÷濾前對照液中A的含量×濾前對照液體積)×100%

2.3.4 超濾試驗 每種超濾膜各平行做3次，按上述樣品按2.3項下超濾條件對其進(jìn)行超濾及皂苷含量的測定，結(jié)果見表2。

表2 不同截留分子量及不同材質(zhì)超濾膜對人參總皂苷溶液中有效成分的透過率Tab.2 Transm ittance of ginsennosides by ultrafiltration membranes of different cut-off molecular weight and different materials

表2表明3種不同截留分子量的聚醚砜材質(zhì)超濾膜整體上對原人參三醇型皂苷人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2的透過率優(yōu)于原人參二醇型皂苷人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3，其中30 kDa、50 kDa、100 kDa聚醚砜材質(zhì)膜和30 kDa、100 kDa纖維素材質(zhì)膜對原人參三醇型皂苷人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2的透過率均在90% 以上，聚醚砜材質(zhì)的30 kDa、50Kda、100 kDa膜對原人參二醇型皂苷人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的透過率雖隨截留分子量的增大而增大，但即使截留分子量相對較大的100 kDa膜對這幾種原人參二醇型皂苷的透過率也不理想。而將截留分子量相同的聚醚砜材質(zhì)的超濾膜與纖維素材質(zhì)的膜對各人參皂苷的透過率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)纖維素材質(zhì)的膜對原人參二醇型皂苷人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的透過率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于聚醚砜材質(zhì)的超濾膜。

3 討論

3.1 人參皂苷類其成分相對分子量均在1 000左右，理論上均能透過截留分子量為30 kDa以上的超濾膜，但實驗結(jié)果并非如此，說明除物質(zhì)分子量外，還存在著其他因素影響成分的透過率［7］。人參皂苷具有表面活性劑的特性在水溶液中容易聚集形成囊泡或膠束，而阻礙人參皂苷透過超濾膜［8－10］。由于聚醚砜材質(zhì)和纖維素材質(zhì)的超濾膜的親水性有不同，因此其對人參皂苷的透過率也有差別，此實驗表明纖維素材質(zhì)的超濾膜對人參皂苷的透過率要優(yōu)于相同截留分子量聚醚砜材質(zhì)的超濾膜。

3.2 超濾法會對中藥中的有效成分有一定影響。中藥中有效成分種類繁多，其物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)各有異同，彭國平等［11］實驗顯示，聚醚砜超濾膜對中藥類成分的影響具有一定的選擇性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，聚醚砜超濾膜對人參皂苷類成分中各單體皂苷的影響具有較強(qiáng)的選擇性，其對原人參二醇型皂苷的影響明顯大于對原人參三醇型皂苷的影響。纖維素超濾膜對人參皂苷類成分的影響也出現(xiàn)了類似趨勢，但沒有聚醚砜超濾膜明顯，這很可能是由于聚醚砜材質(zhì)比纖維素材質(zhì)疏水性更強(qiáng)。為進(jìn)一步研究上述現(xiàn)象的原因還需從原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解度、理化性質(zhì)等方面具體分析［12－14］。

3.3 目前，超濾技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥產(chǎn)業(yè)，本實驗考察了不同材質(zhì)及不同截留分子量超濾膜對人參皂苷類成分的影響，實驗結(jié)果為超濾技術(shù)應(yīng)用于有人參為處方組成的中藥產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中提供了一定的依據(jù);對應(yīng)用超濾技術(shù)分離純化其它中藥類成分的研究具有一定的借鑒意義。

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