鄒曉燕 張洪武

(1.中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所, 廈門 361021; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微生物易于實(shí)驗(yàn)控制, 已逐漸成為評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)刺激效應(yīng)的模式生物[1]。四膜蟲(chóng)(Tetrahymena pyriformis)是一種單細(xì)胞真核生物, 廣泛存在于自然環(huán)境中, 是水生態(tài)健康的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[2,3]。由于四膜蟲(chóng)繁殖迅速, 在最適條件下大約每 2.5—3h可以分裂一次;只需進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng), 就能得到數(shù)量較多的實(shí)驗(yàn)材料, 被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)[4—6], 在基礎(chǔ)研究中一直處于前沿地位[7]。目前在毒性測(cè)試過(guò)程中,常用于評(píng)價(jià)四膜蟲(chóng)毒性效應(yīng)的方法有血小板計(jì)數(shù)法[8]、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法[9]、比濁法[9]、干重法、生物熒光法等。血小板計(jì)數(shù)法過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、重復(fù)性差, 不能及時(shí)反應(yīng)四膜蟲(chóng)的生物情況, 不適合檢測(cè)大批量樣品; 而其他方法不能區(qū)分細(xì)胞的死活?？扇苄脏邕蛩{(lán)(WST-8)是一種類似于四甲基噻唑藍(lán)(MTT)的化合物, 在電子耦合試劑存在的情況下, 可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚[10]。與傳統(tǒng)MTT比色法相比, 不必洗滌細(xì)胞和收集細(xì)胞, 也不必采用額外的步驟去溶解甲瓚, 適合大批量樣品的檢測(cè)。此外, WST-8法目前多用于免疫細(xì)胞的檢測(cè)[11,12], 很少用于檢測(cè)微生物的細(xì)胞活性。本研究用WST-8比色法檢測(cè)梨形四膜蟲(chóng)的細(xì)胞活性, 并將結(jié)果與常規(guī)計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

GL-C梨形四膜蟲(chóng)(T.pyriformis)由中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所楊軍課題組提供。在 30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—30h。

PPYS培養(yǎng)基： 0.5%葡萄糖, 0.25%酵母浸粉, 0.25%胰蛋白胨, 25 mL分裝于 100 mL三角瓶中, 120℃滅菌30min, 冷卻備用。葡萄糖購(gòu)置汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品公司, 酵母浸粉和胰蛋白胨購(gòu)置北京索萊寶科技有限公司(Beijing solarbio science & Technology Co., Ltd.), 上述試劑均為AR純, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均使用超純水配制。

1.2 試劑

CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒(含 WST-8試劑)購(gòu)置碧云天生物技術(shù)研究所; 固定液： 用pH 7.2 PBS緩沖液將 25%戊二醛稀釋至 3.0%; 玻璃儀器在使用前均用10%硝酸浸泡48h, 并用超純水沖洗干凈。

1.3 WST-8比色法測(cè)定

將不同濃度梯度的四膜蟲(chóng)培養(yǎng)液加入96孔板, 每孔100 μL, 各做三個(gè)平行, 然后每孔加入10 μL WST-8試劑,30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 0.5、1、2、3、4、5和 6h后取出, 用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm下的吸光值(A450)。

1.4 常規(guī)計(jì)數(shù)法測(cè)定

取不同濃度梯度的四膜蟲(chóng)培養(yǎng)液300 μL, 加入25 μL 3.0%固定液, 混勻。然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù), 每個(gè)樣品鏡檢3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次, 結(jié)果用(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示, 利用Origin8.0對(duì)其進(jìn)行線性回歸相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 WST-8添加量對(duì)空白值的影響

從圖 1中可以看出, 隨著 WST-8加入量的增加, 背景空白越高, 當(dāng)WST-8加入量達(dá)到20 μL時(shí), 培養(yǎng)基空白達(dá)到 0.201±0.003, 該值遠(yuǎn)超樣品的檢測(cè)結(jié)果; 當(dāng) WST-8加入量為 5 μL時(shí), 雖然空白值較低, 但其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD較大(RSD5μL=15.2%,RSD10μL=3.5%,RSD20μL=1.9%。從空白值考慮, 該檢測(cè)方法WST-8最適加入量為10 μL。

2.2 WST-8的培養(yǎng)時(shí)間

圖2結(jié)果顯示樣品吸光度A450隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。樣品加入WST-8培養(yǎng)4h后其A450基本保持不變,變化率小于5.0%/h。

2.3 不同濃度對(duì)WST-8法檢測(cè)結(jié)果的影響

圖1 不同劑量WST-8對(duì)空白值的影響Fig.1 The effect of different dosage WST-8 on blank values

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)吸光度A450值的影響Fig.2 Effect of different inoculation time on A450

圖3表示不同濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。接種量在2%—32%范圍內(nèi)時(shí),A450隨接種量增加而增大。接種量越大,加入WST-8后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響越明顯。接種量越大, 四膜蟲(chóng)培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng), 即四膜蟲(chóng)細(xì)胞密度越大, 檢測(cè)結(jié)果的誤差越大。四膜蟲(chóng)接種量為32%和40%, 四膜蟲(chóng)培養(yǎng)27h后 WST-8法檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD達(dá)到25.8%和41.2%。

2.4 WST-8法與常規(guī)計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果比較

圖5結(jié)果顯示, 四膜蟲(chóng)接種量在 2%—24%范圍內(nèi),WST-8與計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果均隨四膜蟲(chóng)接種量的增加而逐漸加大,A450與四膜蟲(chóng)細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)R=0.879,經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析P<0.01, 說(shuō)明兩種檢測(cè)方法結(jié)果呈極顯著正相關(guān)。接種量越大, WST-8與計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性越弱。這是因?yàn)?WST-8法檢測(cè)的是活細(xì)胞的數(shù)目, 接種量越大, 相同時(shí)間內(nèi)死亡的四膜蟲(chóng)數(shù)量也越多,A450越小, 但四膜蟲(chóng)絕對(duì)細(xì)胞數(shù)卻是增加的。從圖5a可以看出,接種量達(dá)到40%時(shí),A450值明顯低于接種量為32%的樣品;圖5b接種量達(dá)到40%時(shí),A450值與接種量為32%的樣品相當(dāng), 這是因?yàn)樵跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下, 接種量大的四膜蟲(chóng)樣品進(jìn)入了新的生長(zhǎng)周期, 細(xì)胞增殖, 活細(xì)胞數(shù)目增加,A450值增大。

2.5 用 WST-8方法檢測(cè)五價(jià)砷(As(Ⅴ))對(duì)梨形四膜蟲(chóng)的毒性效應(yīng)

圖3 接種量對(duì)A450值的影響(A.四膜蟲(chóng)培養(yǎng)24h; B.四膜蟲(chóng)培養(yǎng)27h)Fig.3 Effect of different inoculation amount on A450 (A.24h after incubation; B.27h after incubation)

圖4 不同接種量對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD的影響(加入WST-8后培養(yǎng)時(shí)間為4h)Fig.4 Effect of different inoculation amount on relative standard deviation (4h after adding WST-8)

圖5 常規(guī)計(jì)數(shù)法與WST-8法結(jié)果比較(A.四膜蟲(chóng)培養(yǎng)24h;B.四膜蟲(chóng)培養(yǎng)27h)Fig.5 Results comparison using conventional counting method and WST-8 colorimetric method(A.24h after incubation; B.27h after incubation)

圖6分別用計(jì)數(shù)法和WST-8法檢測(cè)As(Ⅴ)對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性效應(yīng)。計(jì)數(shù)法和WST-8法檢測(cè)結(jié)果具有相同的變化趨勢(shì), 即低濃度As(Ⅴ)能夠促進(jìn)四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng), 高濃度As(Ⅴ)抑制四膜蟲(chóng)生長(zhǎng)。原因可能是低濃度外源物質(zhì)可引起生物體應(yīng)急反應(yīng), 但濃度過(guò)高則產(chǎn)生毒性, 抑制生物體生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞活性[6]。兩種檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的半效應(yīng)濃度EC50分別為1.21 mg/L和0.88 mg/L。

3 討論

圖6 As(Ⅴ)對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性效應(yīng)Fig.6 Toxic effect of As(Ⅴ) on T.pyriformis

眾所周知, WST-8是一種類似于MTT的顯色劑, 可以檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)[9], 活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能還原WST-8形成橙黃色晶體, 細(xì)胞增殖越多越快, 則顏色越深; 細(xì)胞毒性越大, 則顏色越淺, 采用酶標(biāo)儀在 450 nm處測(cè)其吸光度可間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。但是當(dāng)體系中存在影響細(xì)胞生長(zhǎng)的因素時(shí), 常會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)空白背景值的比較, 確定 WST-8最適加入量為10 μL, 對(duì)加入 WST-8后的培養(yǎng)時(shí)間比較,確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為4h。接種量在2%—24%范圍內(nèi), 計(jì)數(shù)法與 WST-8法檢測(cè)結(jié)果呈極顯著正相關(guān)(R=0.879,P<0.01), WST-8法在此范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為10%, 具有較好的重現(xiàn)性。用計(jì)數(shù)法和 WST-8法檢測(cè)As(Ⅴ)對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性, 結(jié)果具有相同的變化趨勢(shì), 半效應(yīng)濃度分別為1.21和0.88 mg/L, 這說(shuō)明計(jì)數(shù)法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果包括已死亡的四膜蟲(chóng), 故使其獲得的半效應(yīng)濃度值高于WST-8法。WST-8法能夠更準(zhǔn)確地反應(yīng)出As(Ⅴ)對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性效應(yīng)。

在有關(guān)微生物的工作中對(duì)其生長(zhǎng)及活性的評(píng)價(jià)是非常重要的。用常規(guī)計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)毒物對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性時(shí), 死亡細(xì)胞和存活細(xì)胞常常難以區(qū)分, 一般是通過(guò)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行主觀判斷, 涂板過(guò)程工作量大。采用 WST-8法只需將 WST-8試劑按一定比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng), 活細(xì)胞即可將 WST-8代謝為黃色的水溶性甲瓚染料, 直接在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。與常規(guī)計(jì)數(shù)法相比, WST-8法減少計(jì)數(shù)過(guò)程人為的主觀誤差, 大大減輕了工作量, 結(jié)果顯示為活細(xì)胞的數(shù)量或微生物細(xì)胞的活性, 具有傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。WST-8法可以快速、簡(jiǎn)便地分析四膜蟲(chóng)的細(xì)胞活性。

致謝：

四膜蟲(chóng)的培養(yǎng)得到了中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境所楊軍研究員以及張永雨副研究員的指導(dǎo)和幫助。

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