陳 光，曹雅明，劉 蕾，蔡連順，畢 勝，蘇菊香，代 月

(1.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院寄生蟲學教研室，黑龍江佳木斯 154007;2.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽 110001;3.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，黑龍江佳木斯 154007)

瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。每年全世界約有655萬人感染瘧疾，其中將近100萬人死亡，絕大多數(shù)為5歲以下的兒童［1-2］。新的研究證實，不同種屬瘧原蟲混合感染在發(fā)展中國家是一種普遍現(xiàn)象。尤其在瘧疾流行區(qū)，惡性瘧原蟲同時伴隨間日瘧原蟲或三日瘧原蟲混合感染約占瘧疾總感染人數(shù)的30%以上［3-5］。瘧疾的流行已成為全球性最嚴重的三大公共衛(wèi)生問題之一，給全球尤其是發(fā)展中國家?guī)砹藝乐氐慕】滴：统林氐慕?jīng)濟負擔［6］。到目前為止，無有效疫苗能有效地預防瘧疾感染［7］。因此，研制安全、價廉和有效的瘧疾疫苗是人類控制乃至根除瘧疾的重要途徑，也是當今世界迫切需要解決的重點課題。而瘧原蟲感染宿主機體應答的免疫學、分子生物學等綜合基礎(chǔ)研究是其重要前提。瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應機制對其控制和消除。同時，由于過強的炎癥反應引起腦瘧等免疫病理損傷也是這一疾病的突出特征。IL-10是一種抗炎性細胞因子，由巨噬細胞(M?)、樹突狀細胞(DC)、B細胞以及CD4+和CD8+T細胞亞類分泌。IL-10通過抑制M?和DCs的功能，限制了Th1/Th2型免疫應答的發(fā)生;DC或M?分泌的IL-10能誘導自然調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)產(chǎn)生IL-10，從而阻止了宿主病理損傷的出現(xiàn)，但卻允許病原體長期逃避免疫系統(tǒng)控制并引起長期(通常無癥狀)感染［8］。目前，IL-10在瘧疾感染尤其是混合感染中作用的研究尚未深入展開。有限的研究結(jié)果顯示，一種瘧原蟲單獨感染時IL-10是由自然調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)、Th1/Tr1、DC和M?分泌的，其主要作用地位體現(xiàn)在抑制Th1應答，減少IL-12和IFN-γ的分泌;通過抗體中和或基因敲除，發(fā)現(xiàn)IL-10-/-小鼠TNF-α、IFN-γ水平增高，瘧原蟲清除能力增強，死亡率升高，發(fā)生免疫病理損傷/腦瘧的機率明顯增加［8-10］。因此，本實驗擬利用P.y17XL、P.cAS單獨感染和P.y17XL+P.cAS混合感染鼠瘧模型，明確IL-10在瘧疾混合感染過程中的作用地位，這一研究無疑將為瘧疾等感染性疾病的有效控制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、瘧原蟲 6～8周齡、雌性DBA/2小鼠由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供(許可證編號:SCXK京200420001);P.y17XL和P.cAS(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈)。

1.1.2 主要試劑 SYBR GREEN quantitative kit(Quigen，Germany);IL-10R Ab(clone 1B1.3a;Biolegend company)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物感染及分組 DBA/2小鼠分為正常對照組、P.y17XL單獨感染組、P.y17XL和P.cAS瘧原蟲混合感染組和P.cAS單獨感染組，9只/組，分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL、P.cAS和P.y17XL+P.cAS(1∶1)寄生的紅細胞，感染不同時間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，光學顯微鏡鏡檢瘧原蟲，計數(shù)紅細胞感染率。

1.2.2 實時定量PCR檢測蟲負荷 于感染第后3、5、8、10、12和19天分別尾靜脈取血100 μL，肝素抗凝后短暫離心，采用高純度DNA提取試劑盒抽提DNA;根據(jù)2種瘧原蟲的MSP-1基因序列，設(shè)計特異性引物:P.y17XL MSP-1 F5'-ACCATCAACATCTACACCAGCAC-3'，R5'-CAGGCATATCCTCTTCACTTTCT-3'，擴增長度為 110 bp;P.cAS MSP-1 F5'-GTAACATC ACAACCAGCATCAAC-3'，R5'-CGACAAACATTTCGTCTTCACTT-3'，擴 增 長度為100 bp。

1.2.3 脾細胞培養(yǎng) 分別于感染后第0、1、3、5、8、10、12和 15天，無菌取出小鼠脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)液制備濃度為1×107個/mL脾細胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清，-80℃保存。

1.2.4 細胞因子的檢測 用雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平，按試劑盒說明操作，酶標儀測定450 nm處吸光度(A)值。以試劑盒提供的標準品測定結(jié)果繪制標準曲線，應用SoftMax Pro 4.3.1LS軟件分析，計算細胞因子含量(pg/mL)，結(jié)果以±s表示。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 11.5統(tǒng)計學分析軟件，雙尾t檢驗分析比較各組間的統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘧疾混合感染小鼠原蟲血癥水平及生存率

P.cAS感染小鼠原蟲血癥水平迅速持續(xù)升高，感染后第9、10天達峰值約33.17±10.89%，感染小鼠全部死亡;而P.y17XL感染小鼠全部存活，感染后3 d和9 d原蟲血癥水平僅為1.66±0.4%和24.9±7.1%，隨后迅速下降;相比P.y17XL+P.cAS混合感染小鼠的原蟲血癥水平也于感染后9 d達峰值約34±5.5%，小鼠生存率為100%(見圖1A、1B)。

圖1 瘧原蟲感染小鼠不同時間原蟲血癥水平(A)及生存率(B)Fig.1 Parasitemia(A)and survival rate(B)of P.y17XL，P.y17XL+P.c AS and P.c AS infection in DBA/2 mice in different time after infection

2.2 瘧疾混合感染小鼠蟲負荷水平檢測

同等數(shù)量的P.y17XL和P.cAS瘧原蟲混合后腹腔注射DBA/2小鼠，RTQ-PCR檢測感染小鼠體內(nèi)2種瘧原蟲蟲負荷水平。小鼠混合感染后3～12 d，P.y17XL 占優(yōu)勢;而感染后 15～19 d，P.cAS占優(yōu)勢(見圖2)。

圖2 瘧疾混合感染小鼠不同時間瘧原蟲蟲負荷水平Fig.2 Quantitative PCR analysis of DBA/2 miceco-infected with P.y17XL and P.cAS.Proportions of each strain measured in mixed-infections mice during the different time point after infection

圖3 混合感染小鼠感染后不同時間脾細胞上清中細胞因子IL-10水平檢測Fig.3 Level of IL-10 in spleen cell supernatants during different infections in different time point

2.3 瘧疾混合感染小鼠IL-10水平變化

混合感染小鼠IL-10水平于感染后第1～3天無明顯變化，感染后第8天達峰值，隨后迅速下降，于感染后第10天下降至正常水平;P.y17XL感染小鼠IL-10水平于感染后第1d既出現(xiàn)有意義的升高，第5天達峰值(P＜0.01)，此后雖有回落但仍維持其高水平;相比，P.cAS感染小鼠IL-10水平在感染后第3d出現(xiàn)迅速的有意義的升高(P＜0.01)，第8天達峰值，是同天混合感染小鼠IL-10水平的2倍(圖3)。

3 討論

瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應機制對其控制和消除。同時，由于過強的炎癥反應引起腦瘧等免疫病理損傷也是這一疾病的突出特征。不斷積累的研究數(shù)據(jù)表明:紅內(nèi)期階段宿主通過強烈的促炎性免疫反應控制瘧原蟲增殖并促進感染紅細胞清除，同時也嚴格調(diào)控免疫介導病理損傷(嚴重合并癥)的程度［9，11］，在瘧疾感染過程中IL-10對促炎性應答具有重要的調(diào)節(jié)作用［12］。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):P.y17XL單獨感染和混合感染小鼠IL-10水平在感染后第5和8天分別達峰值，隨后開始下降至正常水平，小鼠蟲血癥均達中等水平，存活率100%;相比P.cAS感染小鼠IL-10在感染后第3天突然出現(xiàn)高水平升高并且維持時間較長;于感染后第8天達峰值，是同天P.y17XL單獨感染和混合感染小鼠IL-10水平的2倍，蟲血癥水平較高，小鼠全部死亡。由此提示，決定瘧疾混合感染病理損傷嚴重性的應答效應明顯受控于宿主免疫網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)，而IL-10可能正是在瘧疾混合感染的發(fā)生和發(fā)展過程中處于舉足輕重的作用地位。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子IL-10具有雙向免疫調(diào)節(jié)活性，即負向調(diào)節(jié)作用及其免疫刺激作用。IL-10發(fā)揮不同的免疫學功效主要與IL-10蛋白的濃度、不同的微環(huán)境和病理條件及其不同的微環(huán)境、不同細胞和病理條件中IL-10受體表達格局的不同導致了IL-10不同的免疫學活性［13］。

同時發(fā)現(xiàn)，混合感染小鼠于感染后18 d自愈。實時定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合感染小鼠，于感染后3～12 dP.y17XL增殖占優(yōu)勢，而感染后15～19 d則P.cAS增殖處于優(yōu)勢狀態(tài)。相關(guān)的實驗研究證明:與其它瘧原蟲蟲株相比，P.cAS生長相對緩慢，針對生長速度不同的瘧原蟲，宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫應答強度具有明顯差異性［14］;嚙齒類動物混合感染模型證明:感染早期，P.y17XL能抑制P.cAS的生長［15］;同時人們發(fā)現(xiàn)針對一種寄生蟲感染造成的特有的致命性病理損傷能被同時感染的另一種寄生蟲減輕，不同瘧原蟲蟲株之間存在著拮抗作用［16］。

綜上所述，本實驗證實以IL-10為核心的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡與瘧疾感染過程中病理損傷密切相關(guān)。同時提示混合感染小鼠應答模式與P.y17XL感染小鼠的應答模式相同。上述問題的闡明不僅將進一步明晰瘧疾免疫應答相關(guān)機制的本質(zhì)，而且研制誘導物種間交叉免疫為靶向的瘧疾疫苗新策略提供積極的指導意義，同時也為瘧疾的免疫治療手段開拓新的思路。

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