范宏，朱珠，文連奎，許麗麗，王敬涵

（1.吉林工商學院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

甜葫蘆[Lagenaria siceraria（Molina）Standl.var.hispisa（Thund.）Hara]，又名菜葫蘆，干瓢，是屬于葫蘆科葫蘆屬的一種爬藤植物，同時是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蔬菜，不僅含有維生素、葡萄糖和果糖，同時還含有鈣、磷、鉀等多種元素和氨基酸，除其嫩果可食用外，嫩苗、嫩葉亦常作蔬菜食用[1-3]。甜葫蘆含有的葫蘆素是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生物質(zhì)，是葫蘆科30 多屬100 多種植物的特征化合物[4]。近代研究表明葫蘆素在生態(tài)系統(tǒng)中作為異源化學信息素可起到保護葫蘆科植物免受眾多植食性動物和病原菌的侵害的作用[5-7]。葫蘆素同時還具有消退黃疸，消除腹水、抗腫瘤等多種生物活性，在對激發(fā)細胞免疫功能，抑制肝纖維增生等方面也有一定的作用[8-11]。超聲波提取技術是近年來興起的提取技術，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有生產(chǎn)周期短、有效成分不易被破壞、節(jié)約提取成本等優(yōu)點[12]。本實驗利用超聲波輔助浸提工藝，確定超聲波輔助提取甜葫蘆中的葫蘆素E 的最佳提取工藝條件，從而為甜葫蘆的開發(fā)和利用奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甜葫蘆干制品：市售；甲醇（色譜純）；葫蘆素E 標準品（編號130502）：北京捷誠科遠化工技術研究所。

1.1.2 主要儀器

Y92-11 超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；T6 新世紀紫外可見分光光度計：TECHCOMP；TGL-16G 型臺式離心機：上海安亨科學儀器廠；A-88 組織搗碎機：江蘇金壇醫(yī)療儀器廠。

1.2 步驟與方法

1.2.1 葫蘆素E 標準曲線的繪制

1.2.1.1 葫蘆素E 最大吸收峰的測定

取葫蘆素E 的甲醇標準溶液，然后用紫外分光光度計進行全波長掃描（190 nm～1 100 nm），得到葫蘆素E 標準品的最大吸收峰為234 nm，所以將葫蘆素E 的檢測波長確定為234 nm。

1.2.1.2 葫蘆素E 標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的葫蘆素E 標準品2.5 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL 的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的葫蘆素E 標準儲備液，量取該標準儲備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用甲醇定容到10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 的標準溶液，然后在波長234 nm 處測吸光值，以葫蘆素E 的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得線性回歸方程。紫外分光光度法測定葫蘆素E 的含量的標準曲線見圖1。

圖1 葫蘆素E 標準曲線Fig.1 Cucurbitacin E standard curve

1.2.2 樣品中葫蘆素E 含量的測定

將甜葫蘆干制品進行粉碎、過篩（80 目），精確稱量甜葫蘆干粉2 g，放入50 mL 的燒杯中，加入一定體積的甲醇溶液，常溫條件下按一定的超聲條件（料液比，溶劑濃度，提取時間，超聲波功率）提取葫蘆素E，離心10 min，去掉沉淀純化并取上清液，將上清液稀釋100 倍經(jīng)紫外分光光度計測得每個上清液的吸光值，根據(jù)回歸方程計算樣品中葫蘆素E 的含量。葫蘆素E得率的計算公式為：

式中：a 為葫蘆素E 得率，%；m1為樣品溶液中葫蘆素E 質(zhì)量，g；m2為甜葫蘆干粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 超聲波提取葫蘆素E 的單因素及正交試驗設計

分別針對不同的料液比（1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12 g/mL）、溶劑濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（10、15、20、25、30 min）、超聲波功率（200、300、400、500、600 W）影響葫蘆素E 得率的因素進行單因素試驗，并在單因素試驗的基礎上采用L（934）正交試驗，以吸光值為考察指標，確定超聲波輔助提取甜葫蘆中葫蘆素E 的最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取葫蘆素E 的單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對葫蘆素E 得率的影響

在溶劑甲醇濃度為70%，時間為20 min，超聲功率為400 W 條件下對葫蘆素E 的進行超聲波提取，確定適宜的料液比。料液比對葫蘆素E 得率的影響見圖2。

由圖2 可知，當料液比大于1 ∶10（g/mL）時，得率將不再增加。料液比的大小影響著固相主體與液相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動力，料液少，繼而兩相間的濃度差小，從而傳質(zhì)推動力小。其次，料液比的大小還會影響兩相的混合度情況。料液的提高必然會較大程度的提高傳質(zhì)推動力，但同時也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度，所以溶劑也不宜太多。因此，本試驗料液比選擇1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11（g/mL）3 個水平進行正交試驗。

圖2 料液比對葫蘆素E 得率的影響Fig.2 Effect of different rate of solid to solution on yield of cucurbitacin E

2.1.2 溶劑濃度對葫蘆素E 得率的影響

在料液比（g/mL）為1 ∶10，時間為20 min，超聲功率為400 W 條件下對葫蘆素E 的進行超聲波提取，確定適宜的溶劑濃度。溶劑濃度對葫蘆素E 得率的影響分別見圖3。

圖3 溶劑濃度對葫蘆素E 得率的影響Fig.3 Effect of different solvent concentration on yield of cucurbitacin E

由圖3 可知，當溶劑甲醇濃度小于70%時，得率隨之甲醇濃度的增加而增加，甲醇濃度為70%時，得率最大，提取效果最好；但隨著甲醇濃度繼續(xù)增加，得率下降，原因是一些雜質(zhì)同時也溶解出來。因此，本試驗甲醇濃度選擇60%、70%、80%3 個水平進行正交試驗。

2.1.3 提取時間對葫蘆素E 得率的影響

在料液比（g/mL）為1 ∶10，溶劑甲醇濃度為70%，超聲功率為400 W 條件下對葫蘆素E 的進行超聲波提取，確定適宜的提取時間。提取時間對葫蘆素E 得率的影響分別見圖4。

由圖4 可知，隨著提取時間的增加，葫蘆素E 得率先升高后降低，當提取時間為20 min 時，葫蘆素E得率最高。因此，本試驗提取時間選擇15、20、25 min 3 個水平進行正交試驗。

2.1.4 超聲波功率對葫蘆素E 得率的影響

圖4 超聲時間對葫蘆素E 得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on yield of cucurbitacin E

在料液比（g/mL）為1 ∶10，溶劑甲醇濃度為70%，時間為20 min 條件下對葫蘆素E 的進行超聲波提取，確定適宜的超聲波功率。超聲波功率對葫蘆素E 得率的影響分別見圖5。

圖5 超聲時間對葫蘆素E 得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic power on yield of cucurbitacin E

由圖5 可知體系中介質(zhì)分子的振動速度會隨著超聲功率的增加而增大，在超聲強度高于空化閾值后，空化氣泡也就隨著介質(zhì)分子振動速度的增大而增多，空化效果也就更明顯[13]，本實驗超聲功率為400 W時，葫蘆素E 得率最高。因此，本試驗超聲波功率選擇300、400、500 W 3 個水平進行正交試驗。

2.2 超聲波提取葫蘆素E 的正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎上，對影響葫蘆素E 得率的因素進行L9（34）正交試驗（見表1），葫蘆素E 正交試驗結(jié)果見表2。

表1 葫蘆素E 提取的L9（34）正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels design of L9（34）orthogonal tests for cucurbitacin E extraction

由極差R 大小分析可知，影響葫蘆素E 提取效果因素的主要因素順序為B＞C＞A＞D，即溶劑濃度＞時間＞料液比＞超聲波功率，由K 值可知，其最優(yōu)組合為A2B2C1D3，即料液比1 ∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時間15 min、超聲功率500 W。然而通過正交試驗得出的最佳條件組合并不在正交試驗表的9 個試驗內(nèi)。因此為了得到確定的結(jié)果，按照上面得出的最佳條件A2B2C1D3進行驗證試驗。

表2 葫蘆素E 提取正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests for cucurbitacin E extraction

2.3 最佳工藝條件驗證試驗

按A2B2C1D3，即料液比1∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時間15 min、超聲功率500 W 的條件下分別進行3 次葫蘆素E 超聲波提取的平行實驗，平均得率為0.695%，由此可知正交試驗的結(jié)果是準確的，確定A2B2C1D3為葫蘆素E 超聲波提取的最佳工藝選擇。

2.4 不同因素對葫蘆素E 得率的影響分析

由2.2 可知，溶劑濃度對葫蘆素E 的提取效果影響最大，超聲波功率影響最小，時間和料液比依次次之。原因是依據(jù)相似相溶原理，葫蘆素E 易溶于有機溶劑，所以溶劑濃度對葫蘆素E 的提取效果影響較大。超聲波破碎過程是一個物理過程，而根據(jù)甜葫蘆的屬性和葫蘆素E 的結(jié)構特性，葫蘆素E 的提取效果受超聲波功率影響最小。

3 結(jié)論

通過單因素試驗與正交試驗得到了最佳的提取條件為：料液比1 ∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時間15 min、超聲功率500 W。在此條件下葫蘆素E 的得率為0.695%

[1]郭本功.保健佳蔬話瓠瓜[J].蔬菜,2003(9)：34

[2]邱明華,陳書坤,陳劍超,等.葫蘆科化學分類學[J].應用與環(huán)境生物學報,2005(12)：20

[3]周玲.瓠瓜的藥用食療與菜譜[J].食療烹苑,1997(8)：43

[4]Metcalf R L.Coevolutionary adaptations of rootworm beetles(Coleoptera Chrysomelidae) to cucurbitacins[J].Journal of chemical ecology,1986,12(5)：1109-1124

[5]Tallamy DW,Stull J,Ehresman NP,et al.Cucurbitacins as feeding and oviposition deterrents to insects[J].Environmental entomology,1997,26(3)：678-783

[6]Tallamy DW,Whittington DP,Defurio F,et al.Sequestered cucurbitacins and pathogenicity of Metarhizium anisopliae(Moniliales Moniliaceae)on spotted cucumber beetle eggs and larvae(Coleoptera Chrysomelidae)[J].Environmental entomology,1998,27(2)：366-372

[7]Balkema-Boomstra AG,Zijlstra S,Verstappen FWA,et al.Role of cucurbitacin Cresistance to spidermite(Tetranychusurticae) in cucumber(Cucumissativus L)[J].Journal of chemical ecology,2003,29(1)：225-235

[8]劉昌孝,張振倫,葉桂珍,等.葫蘆素BE 的藥理研究[J].中草藥,1985,16(10)：21-23

[9]Chen JC,Chiu MH,Nie RL,et al.Cucurbitacins and cucurbitane glycosides：structures and biological activities[J].Nat Prod Rep,2005,22(3)：386-399

[10]湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所藥理室肝炎組.葫蘆素B、E 抗肝炎藥理研究[J].中草藥,1982,13(11)：25-26

[11]湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所藥理室肝炎組.甜瓜蒂抗肝炎有效成分的藥理研究[J].中草藥通訊,1979(9)：30-32

[12]張曄,趙晶晶,王鍇,等.超聲波輔助提取辣椒紅色素[J].食品研究與開發(fā),2011,32(1)：71-74

[13]吳永福,汪一飛.茶葉深加工產(chǎn)品開發(fā)的現(xiàn)狀[J].中國茶葉,2001,23(6)：39-31