孫勇民，岳鹍，王芃

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院，天津 300350）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc）為蓼科多年生草本植物，主要含有蒽醌類化合物、芪類化合物、水溶性多糖和鞣質等成分，其中芪類化合物中的功能性成分白藜蘆醇因其抑制癌細胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延緩衰老等作用明顯，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物[1]。

虎杖中白藜蘆醇通常以苷元和皂苷兩種形式存在，白藜蘆醇甙是白藜蘆醇的葡萄糖甙，白藜蘆醇甙在一定的條件下可以通過酶解脫去葡萄糖基而轉化為白藜蘆醇。目前常用的堿提酸沉法、微波提取、超聲萃取法等能有效提取白藜蘆醇，卻無法有效轉化白藜蘆醇苷，造成資源的極大浪費和生產(chǎn)成本的增加[2-3]。

本試驗采用纖維素酶和阿魏酸酯酶組成的復合酶對虎杖中的白藜蘆醇進行提取，復合酶中的阿魏酸酯酶可切斷木質素和半纖維素的交聯(lián)架構，有利于虎杖細胞內(nèi)容物的溶出；纖維素酶則可有效地將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇。兩種酶的配合使用，可顯著提高虎杖中白藜蘆醇的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇對照品，購于Sigma 公司（含量99%）；虎杖：購于天津藥材市場，產(chǎn)地為安徽亳州。阿魏酸酯酶（1.5×104IU/g）、纖維素酶（1.5×104IU/g）：寧夏夏盛集團；無水乙醇、甲醇：國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

BS224S 型電子分析天平：德國賽多利斯股份公司；DSHZ-300 型多用途恒溫水浴振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；T6 紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；RE-52CS 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DZ-2BCⅡ型真空干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇酶法提取工藝

稱取粉碎至60 目的虎杖粉末樣品5.0 g，按料液比1 ∶20（g/mL）加入水后，在不同酶添加量、酶解pH、酶解溫度下，酶解一定時間后加入定量的甲醇，恒溫加熱提取一定時間，減壓抽濾、離心后定容至100 mL。

1.2.2 復合酶酶法提取工藝的優(yōu)化

在單因素預試驗基礎上，考慮濃度等因素對后續(xù)提取的影響，選取酶添加量、酶解溫度、pH 和時間4 個因素，設計四因素三水平正交試驗方案，其因素水平表見表1。

表1 復合酶解法提取條件正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on enzymatic extraction

1.2.3 白藜蘆醇的測定方法[4]

稱取白藜蘆醇標準品5.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻得濃度為0.10 mg/mL 的白藜蘆醇標準儲備液。吸取標準儲備液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，定容后在306 nm 波長下分別測定其吸光值。

以溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制白藜蘆醇的標準曲線，得到其回歸方程為Y=0.122 1X+0.002 3，R2=0.999 7。白藜蘆醇標準溶液濃度在0.00～8.00 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1 白藜蘆醇標準工作曲線Fig.1 Standard curve of resveratrol

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶添加量對白藜蘆醇提取率的影響

取5.0 g 虎杖粉末，分別按表2 中的比例添加復合酶，在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解溫度50 ℃、pH5.0 的條件下，酶解2.5 h，白藜蘆醇的提取結果見表2。

表2 酶添加量對白藜蘆醇提取率的影響Table 2 The effects of enzyme concentration on the extraction rate of resveratrol

由表2 可知，纖維素酶和阿魏酸酯酶混合使用時，白藜蘆醇的提取率有明顯提高；纖維素酶和阿魏酸酯酶的比例不同對白藜蘆醇的提取率也有顯著的影響，當纖維素酶和阿魏酸酯酶添加量均為1.5 mg/g時，白藜蘆醇的提取率達到最大值1.432%。綜合考慮，選擇編號3、4、5 三個水平進行正交試驗。

2.1.2 酶解溫度的確定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解pH5.0、纖維素酶和阿魏酸酯酶添加量均為1.5 mg/g、酶解時間2.5 h 的條件下，分別采用35、40、45、50、55、60 ℃進行提取，以酶解溫度對提取率作圖，分析不同酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響，結果見圖2。

圖2 酶解溫度對白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 The effects of temperature on the extraction rate of resveratrol

由圖2 可知，當酶解溫度為50 ℃時，白藜蘆醇提取率達到最高，當溫度繼續(xù)升高時，白藜蘆醇提取率開始下降，這是由于溫度高于50 ℃，酶蛋白開始變性，導致酶活性降低，影響白藜蘆醇的提取。因此，酶解溫度選擇45、50、55 ℃3 個水平進行正交試驗。

2.1.3 酶解pH 的確定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解溫度50 ℃、纖維素酶和阿魏酸酯酶添加量均為1.5 mg/g、酶解時間2.5 h 的條件下，在pH 分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5時進行提取，以酶解pH 對提取率作圖，分析不同酶解pH 對白藜蘆醇提取率的影響，結果見圖3。

圖3 酶解pH 對白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 The effects of pH on the extraction rate of resveratrol

由圖3 可知，酶解pH 在3.0 到5.0 時，隨著pH 增大，白藜蘆醇的提取率呈現(xiàn)上升趨勢；當pH 等于5.0時，白藜蘆醇的提取率達到最大值1.459%；當pH＞5.0后，白藜蘆醇的提取率呈現(xiàn)下降趨勢?？紤]到纖維素酶最適pH 范圍在4.0～5.5，阿魏酸酯酶最適pH 范圍在4.0～6.5，酶解pH 選擇4.5、5.0、5.5 三個水平進行正交試驗。

2.1.4 酶解時間的確定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、纖維素酶和阿魏酸酯酶添加量均為1.5 mg/g 的條件下，分別采用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 的酶解時間進行提取，以酶解時間對白藜蘆醇的提取率作圖，分析不同酶解時間對白藜蘆醇提取率的影響，結果見圖4。

圖4 酶解時間對白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 The effects of time on the extraction rate of resveratrol

由圖4 可知，反應開始時，底物濃度大，復合酶可快速水解底物，白藜蘆醇提取率隨酶解時間的增加而快速提高，2.5 h 后白藜蘆醇提取率基本穩(wěn)定?？紤]到能耗，酶解時間選擇2.0、2.5、3.0 h 3 個水平進行正交試驗。

2.2 酶解法提取白藜蘆醇最佳工藝條件的確定

在單因素試驗的基礎上，設計復合酶法提取白藜蘆醇L9（34）正交試驗方案，試驗結果見表3。方差分析見表4。

由表3 可知，酶解工藝中影響白藜蘆醇提取率的主次因素為：酶添加量（A）＞酶解溫度（B）＞酶解時間（D）＞pH（C）。提取的最佳條件組合為A2B2C2D3，即固液比1 ∶20（g/mL）、復合酶添加量3 mg/g（1.5 mg/g 纖維素酶+1.5 mg/g 阿魏酸酯酶）、酶解溫度50 ℃、pH 5.0、酶解時間3.0 h。表4 結果表明，復合酶的組成對提取效果影響較大，其他各影響因素的影響程度差異不顯著。

表3 酶解法提取白藜蘆醇正交實驗L9（34）結果與分析Table 3 Result and analysis of orthogonal L9（34）test of the enzymatic extraction

表4 試驗結果方差分析表Table 4 Results of variance analysis

取正交試驗最優(yōu)條件組合A2B2C2D3進行3 次驗證實驗，白藜蘆醇的提取率為（1.513±0.06）%。

2.3 復合酶提取法與其他提取方法的對比分析

選取目前常見的虎杖中白藜蘆醇的提取工藝與復合酶法提取工藝進行對比[5-6]，其提取條件及提取結果見表5。

表5 白藜蘆醇提取工藝的比較Table 5 Comparison of extraction technologies of resveratrol

由表5 可見，酶法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的直接醇提法，這主要是由于虎杖細胞壁的主要成分是纖維素、木質素和果膠，纖維素酶能有效分解纖維素，將細胞壁降解為小分子或易溶物質，促進細胞壁內(nèi)有效成分的釋放。但對于根、莖、皮類藥材，植物細胞壁木質素中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸類物質，以酯鍵方式與半纖維素支鏈形成致密網(wǎng)狀交聯(lián)結構，從空間上限制了纖維素酶對纖維素和半纖維素的有效降解。阿魏酸酯酶可有效切斷木質素和半纖維素的交聯(lián)架構，有利于纖維素酶與底物的接觸，因此復合酶法比單一使用纖維素酶的效果有明顯提高。

3 結論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗，得到虎杖中白黎蘆醇復合酶法提取工藝的最佳條件為：固液比1 ∶20（g/mL）、復合酶添加量3 mg/g（1.5 mg/g 纖維素酶+1.5 mg/g 阿魏酸酯酶）、酶解溫度50 ℃、pH 5.0、酶解時間3.0 h。在此條件下，虎杖中白藜蘆醇的提取率為1.513%。復合酶解法的提取效果明顯優(yōu)于其他方法。

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[3]黃志芳,易進海,劉倩伶,等.酶解法提取純化虎杖提取物中白藜蘆醇的工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,21(5)：1061-1064

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