陳寶，張立穎，沈芳，*，樊紅日，劉雄民，馮龍

（1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣西南寧 530001）

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）屬唇形科迷迭香屬植物[1]，原產(chǎn)地中海沿岸一帶，目前我國很多地區(qū)都有種植。迷迭香中含有萜類、黃酮、有機(jī)酸、多支鏈烷烴及氨基酸等多種化學(xué)成分。其中，黃酮類成分的研究較早，迄今為止已從迷迭香中分離出30 余種黃酮類化合物，主要包括橙皮素、芹菜素、薊黃素、白楊素、高車前苷、6-羥基木犀草素-7-葡萄糖苷等，具有抗菌、消炎、降壓、抗氧化、抗癌等作用[2-3]。迷迭香總黃酮的研究僅見吳建章等[4]對迷迭香黃酮的甲醇索氏提取，且黃酮提取率較低。本試驗(yàn)以廣西巴馬迷迭香為原料，采用乙醇熱浸提法[5-6]提取黃酮類化合物，并優(yōu)化提取工藝，旨在提高總黃酮的提取率，為該資源的開發(fā)利用提供科學(xué)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

廣西巴馬迷迭香；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 儀器

UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；DF-101B 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪予華儀器廠；FZ102 型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香總黃酮的提取

提取工藝流程：干燥的迷迭香→粉碎過60 目篩→石油醚回流脫脂、脫色→風(fēng)干→精確稱取定量脫脂干粉→乙醇回流浸提→冷卻、抽濾→總黃酮提取液→定容至料液比相應(yīng)體積得供試品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[7]

精確稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于50 mL 棕色容量瓶中，用60 %的乙醇溶解并定容至刻度線，配得0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取該蘆丁液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入5 %的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再分別加入10 %的A（lNO）33溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；最后分別加入4 %的NaOH 溶液4.0 mL，用60 %的乙醇溶液定容至刻度線，搖勻，靜置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，于505 nm波長處測定樣液吸光度，并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/mL）與吸光度A 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 總黃酮含量的測定

精密吸取40 μL 供試品溶液置于10 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”中方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算供試品中總黃酮的含量，并用下面的公式計(jì)算總黃酮的提取率：

1.3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取蘆丁對照品溶液適量，按“1.3.2”方法重復(fù)測定6 次，RSD ＝0.31%。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對同一份供試品溶液，每隔5 min 按“1.3.2”方法測定1 次含量，共測6 次，RSD＝1.12%，表明迷迭香提取液在30 min 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密吸取已知含量的樣品6 份，分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，按“1.3.2”方法測定，平均回收率為99.81%，RSD＝2.78%。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度0.002 mg/mL～0.016 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程y=9.685 7x-0.006 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，x 為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/mL），y 為吸光度A。

2.2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）分別加入濃度為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇各40 mL，70 ℃回流提取3 h，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率先增大而后減小。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，總黃酮提取率最大。當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮提取率依次減小，這可能是由于一些脂溶性雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出增多，導(dǎo)致黃酮類化合物的浸出減少。故選擇50%乙醇為迷迭香總黃酮最佳提取濃度。

2.3 料液比對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）分別加入濃度50%乙醇，70 ℃回流提取3 h，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of total flavonoids

由圖3 可知，隨著提取溶劑的增加，總黃酮提取率先增大而后減小。當(dāng)原料一定時(shí)，溶劑用量越多原料顆粒周圍濃度越低，細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差越大，這樣有利于有效成分的溶出。料液比為1 ∶20（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率最大。當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時(shí)，因溶劑揮發(fā)帶來的損失會(huì)增大，導(dǎo)致提取率有所減小。故選擇1 ∶20（g/mL）為迷迭香總黃酮最佳提取料液比。

2.4 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入濃度50%乙醇，70 ℃分別回流提取1、2、3、4、5 h，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

由圖4 可知，當(dāng)提取時(shí)間為3 h 時(shí)，總黃酮提取率最大，繼續(xù)延長提取時(shí)間，提取率反而略微減少，并趨于平穩(wěn)，這可能是由于長時(shí)間浸提使得部分黃酮類化合物受熱損失。故選擇3 h 為迷迭香總黃酮最佳提取時(shí)間。

2.5 提取溫度對總黃酮提取率的影響

精確稱取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入濃度50%乙醇，分別于50、60、70、80、90 ℃回流提取3 h，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids

由圖5 可知，在80 ℃以前，總黃酮提取率隨溫度的升高而逐漸增大。當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，提取率最大。隨著溫度的繼續(xù)升高，總黃酮提取率反而下降，這是因?yàn)楦邷叵氯軇]發(fā)，浸提效果變差，同時(shí)部分黃酮類物質(zhì)可能被破壞，導(dǎo)致提取率的減小。故選擇80 ℃為迷迭香總黃酮最佳提取溫度。

2.6 正交試驗(yàn)

選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

由表2 可知，4 個(gè)因素對總黃酮提取率影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即料液比＞提取時(shí)間＞乙醇濃度＞提取溫度。提取條件的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度為50%，料液比為1 ∶20（g/mL），提取時(shí)間為4 h 和提取溫度90 ℃。在此條件下，3 次重復(fù)試驗(yàn)，迷迭香總黃酮提取率達(dá)6.31%。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of orthogonal test

3 結(jié)論

通過單因素及L（934）正交試驗(yàn)確定迷迭香總黃酮最佳提取工藝條件：乙醇濃度為50%，料液比為1 ∶20（g/mL），提取時(shí)間為4 h 和提取溫度為90 ℃。在最佳提取工藝條件下，提取率為6.31%。

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