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        交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測志賀氏菌

        2013-07-22 07:16:04祁軍張霞蔣剛強(qiáng)蔡國瑞董亞學(xué)鄭文杰
        食品研究與開發(fā) 2013年11期
        關(guān)鍵詞:賀氏菌液特異性

        祁軍,張霞,2,蔣剛強(qiáng),蔡國瑞,董亞學(xué),鄭文杰,*

        (1.天津出入境檢驗檢疫局,天津 300461;2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;3.新疆出入境檢驗檢疫局,新疆烏魯木齊 830063)

        志賀氏菌屬(Shigella)的細(xì)菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌,根據(jù)Igor G 等研究,在成年患者中,只要10 cfu~100 cfu 的志賀氏菌就可通過感染腸道而致病[1],引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng);在幼兒可引起急性中毒性菌痢,死亡率甚高。志賀氏菌主要通過食物或水經(jīng)消化道傳播,導(dǎo)致食源性志賀氏菌流行,與志賀氏菌病相關(guān)的食品包括色拉、生蔬菜、奶及奶制品、水果、肉類、面包制品等。志賀氏菌可以分為痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(S.boy dii)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sonnei)。在發(fā)展中國家,由福氏志賀氏菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位[2]。

        國家標(biāo)準(zhǔn)對于食品中志賀氏菌的檢測方法需要2 d~3 d 才能得到初步結(jié)果,而隨著食品安全檢測標(biāo)準(zhǔn)的提高,尋找更加快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測技術(shù)顯得至關(guān)重要。志賀氏菌的檢測方法很多,ELISA、常規(guī)PCR檢測、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增、脈沖場凝膠電泳、RAPD、基因探針等技術(shù)均在志賀氏菌的檢測和研究中得到廣泛的應(yīng)用[3-10]。

        隨著生物實驗技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,志賀氏菌的檢測和鑒定方法朝著快速簡便、靈敏性高、特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。本研究應(yīng)用一種新的交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)[11],針對編碼4 個血清型的志賀氏菌主要毒力基因——侵襲性質(zhì)??乖璈 基因(ipaH),建立一種既有分子生物學(xué)檢測的高靈敏、高通量,又具有免疫學(xué)檢測的特異性好、操作簡捷,又不需要任何復(fù)雜儀器的快速檢測方法,以適用于基層實驗室和現(xiàn)場快速篩查檢測。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料與試劑

        dNTPs(Fermentas),10×Bst buffer(New England Biolabs),Bst DNA polymerase large fragment(New England Biolabs),MgSO4(Sigma),betaine(Sigma),核酸快速檢測試紙條(杭州優(yōu)思達(dá)公司)。

        菌株采用志賀氏菌6 株(4 株CMCC 菌株、樣品中分離出的2 株野生株)及32 株其他相關(guān)陰性菌,詳見表1。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        PCR 擴(kuò)增儀(Biometra)、離心機(jī)(Eppendorf,5417R)、DNA/RNA/蛋白分析儀(BHIMUZDA,Bio Specmini)。

        表1 試驗菌株Table 1 Bacterial strains for detection

        1.3 方法

        1.3.1 DNA 的提取及定量

        痢疾志賀氏菌CMCC 51252 為試驗菌株,接種于10mL 營養(yǎng)肉湯中,37℃培養(yǎng)16h,取1mL 用于細(xì)菌基因組提取,利用紫外分光光度計檢測DNA 質(zhì)量及純度。

        1.3.2 引物及探針的設(shè)計

        以志賀氏菌EU743831.1 的invasion plasmid antigen(ipaH2)基因DNA 序列為基礎(chǔ),設(shè)計引物序列:

        1.3.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

        通過優(yōu)化,反應(yīng)體系為:10×ThermoPol buffer 2 μL,10 mmol/L dNTP 0.8 μL,100 mmol/L MgSO40.6 μL,5 mol/L Betaine 2 μL,8U/μL Bst DNA pol 1 μL,2μmol/L SHIF3/SHIB3 0.5μL/0.5μL,20 μmol/LSHICPR20.6 μL,20 μmol/L SHIDF5F/SHIDF5B 0.5 μL/0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

        反應(yīng)條件:64 ℃反應(yīng)60 min。

        1.3.4 特異性試驗

        對表1 中菌株核酸樣本進(jìn)行試驗,以證明檢測方法是否具有通用性及特異性。

        1.3.5 靈敏度試驗

        通過對過夜培養(yǎng)CMCC 51252 菌液取1 mL 做細(xì)菌計數(shù),用PBS 對菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10-8,取1 mL 提取細(xì)菌基因組做實驗?zāi)0?。按照反?yīng)體系進(jìn)行試驗,試驗重復(fù)六次。

        1.3.6 干擾菌試驗

        取大腸桿菌43046,沙門氏菌50041,陰溝腸桿菌45301 共3 株菌作為干擾菌株,營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)菌液濃度大約為108cfu/mL 左右,進(jìn)行10 倍梯度逐倍稀釋到濃度為107cfu/mL~101cfu/mL。

        準(zhǔn)備3 個錐形瓶,3 個瓶中接入終濃度分別為(1)103cfu/mL 51252+105cfu/mL43046;(2)103cfu/mL 51252+105cfu/mL50041;(3)103cfu/mL 51252+105cfu/mL 45301 3 種干擾菌混合。取1 mL 混合液提取DNA 做實驗?zāi)0?,按照反?yīng)體系進(jìn)行試驗。

        1.3.7 實際樣品檢測

        用該研究建立的檢測方法體系與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法同時對來源于不同國家的不同種類食品的58 份實際樣品進(jìn)行普查檢測,確定該檢測體系的假陽性率及假陰性率,客觀全面分析評估建立的檢測體系可操作性及準(zhǔn)確率。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 特異性試驗

        檢測38 株實驗菌株,其中6 株志賀氏菌檢測全部為陽性,圖1 是志賀氏菌檢測結(jié)果;其余32 株陰性相關(guān)菌檢測為陰性,圖2 為部分腸桿菌科其他陰性菌株的試驗結(jié)果,說明該方法特異性良好,而且對于志賀氏菌檢測具有很好的通用性。

        圖1 志賀氏菌特異性檢測Fig.1 Specificity of detecting Shigella strains

        圖2 非志賀氏菌特異性檢測Fig.2 Specificity of detecting for non-Shigella bacterial strains

        2.2 靈敏度試驗

        2.2.1 純菌液靈敏度檢測

        CMCC 51252 過夜菌液計數(shù)為7.3×108cfu/mL,用PBS 對菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至7.3×101cfu/mL,各取1 mL 提取細(xì)菌基因組做實驗?zāi)0?,結(jié)果見圖3,靈敏度達(dá)到103cfu/mL。

        圖3 志賀氏菌CMCC 51252 菌液靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity of detecting Shigella CMCC51252 in pure culture

        2.2.2 干擾菌試驗

        對1.3.6 步驟的混合菌液進(jìn)行檢測,試驗結(jié)果表明在干擾菌終濃度均達(dá)105cfu/mL 的情況下,檢測靈敏度沒有發(fā)生明顯變化,依舊為達(dá)103cfu/mL。

        2.3 實際樣品檢測

        對58 份實際樣品進(jìn)行普查檢測,金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)生化檢測結(jié)果陽性樣品4 個,該檢測方法陽性結(jié)果6 個,兩種檢測方法結(jié)果大致相符,新建立的方法沒有漏檢情況,有可能出現(xiàn)假陽性,但發(fā)生率較低,適用于樣品檢測初篩要求。

        3 結(jié)論

        隨著食品安全檢測標(biāo)準(zhǔn)的提高,尋找更加快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測技術(shù)顯得至關(guān)重要。志賀氏菌的檢測方法隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,將得到不斷地改進(jìn)和完善,并朝著快速簡便、靈敏性高、特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。

        近年來,以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的微生物學(xué)檢測得到較快發(fā)展,與傳統(tǒng)檢測手段相比,能更快發(fā)現(xiàn)食品中存在的微生物安全隱患。交叉引物結(jié)合免疫金標(biāo)試紙條檢測是一種新型的等溫擴(kuò)增檢測方法,消除了PCR、實時熒光PCR 對儀器的依賴,同時與環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法(LAMP)相比,其檢測結(jié)果的觀察更為直觀、客觀、便捷,只需依據(jù)試紙條上檢測線的有無即可明確判定陰陽性結(jié)果,避免了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增使用肉眼觀察沉淀或顏色變化的主觀性。該方法不需要儀器設(shè)備及其高度靈敏、特異及快速的優(yōu)點對于普及分子生物學(xué)方法在基層和經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)具有重要的意義。

        本研究根據(jù)1987 年Buysse 等發(fā)現(xiàn)志賀氏菌侵襲性質(zhì)粒抗原H(ipaH)[12]基因建立交叉引物恒溫擴(kuò)增方法,具有較好靈敏度。該基因呈多拷貝存在于菌體的質(zhì)?;蛉旧w上,是志賀氏菌檢測中常用到的目的基因。許龍巖等[13]根據(jù)ipaH 基因序列設(shè)計引物建立PCR方法,特異性高,能檢測出志賀氏菌屬的4 個種群;趙麗華等[14]利用分子信標(biāo)PCR 方法以該基因為目的基因,檢測樣品準(zhǔn)確率達(dá)到100%。本研究建立檢測檢測方法無論有無干擾菌,檢測靈敏度均可穩(wěn)定達(dá)到103CFU/mL 可滿足樣品檢測需求。通過與金標(biāo)準(zhǔn)同時進(jìn)行實際樣品檢測比較,結(jié)果大致相符,沒有漏檢情況出現(xiàn),但有可能出現(xiàn)假陽性,發(fā)生率較低。實驗結(jié)果表明,該方法操作簡便,不需要特殊設(shè)備,適合于基層實驗室對于樣品的快速篩選檢測。

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