殷海松，喬長晟，秦韶燕，湯衛(wèi)華，賈士儒

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中國）有限公司，天津 300457）

冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。主要分布于青海、西藏、四川、云南、甘肅、貴州等地高寒地帶和雪山草原等省區(qū)[1-2]。

冬蟲夏草具有具有補(bǔ)虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效等功效。蟲草多糖、蟲草酸和蟲草素是冬蟲夏草的主要活性物質(zhì)[3]。但由于過度采集，自然界中野生蟲草越來越少，而且價格很高。冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)，國內(nèi)外均有很多研究報道，并有一系列藥品和保健食品在市場上銷售，而且經(jīng)多年的臨床使用，冬蟲夏草人工菌絲制品的藥理作用與天然冬蟲夏草幾乎一致[4]，個別有益指標(biāo)高于天然冬蟲夏草，但其價格要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然蟲草。因此通過冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵獲得菌絲體和代謝產(chǎn)物非常有實際價值。

本文采用單因素試驗法，優(yōu)化了冬蟲夏草發(fā)酵培養(yǎng)基，從而一定程度上提高了冬蟲夏草生物量和胞外多糖產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 菌株

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis.）：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面種子培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

培養(yǎng)基（A）：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。

培養(yǎng)基（B）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[5]。

培養(yǎng)基（C）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[6]。

培養(yǎng)基（D）：葡萄糖40 g/L、黃豆粉40 g/L、酵母膏5 g/L、KH2PO42.5 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L[7]。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2401 紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；FA2004 電子天平：上海精科天平；梅特勒FiveGo便攜式pH 計：瑞士梅特勒托利多；DGG 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；LD5-10 型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；YHG-Ⅱ迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司。

1.4 測定方法

1.4.1 生物量的測定

(4)實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)物聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器集數(shù)據(jù)采集、匯集為一體，可以獨立記錄單點居室數(shù)據(jù)，未來推廣后也可做為匯聚層收集多個居室，跨區(qū)域居室的數(shù)據(jù)，有效了解城市不同區(qū)域內(nèi)環(huán)境情況，提供環(huán)境大數(shù)據(jù)分析參考依據(jù)。

取20 mL 搖瓶培養(yǎng)液，離心機(jī)4 000 r/min 離心20 min，除去上清夜，水洗、再離心，重復(fù)3 次。收集菌絲體，60 ℃烘干至恒重，在干燥器中冷卻到常溫，稱量。

1.4.2 冬蟲夏草胞外多糖的提取與測定方法

1.4.2.1 胞外多糖的提取方法

將發(fā)酵液于4 000 r/min 離心20 min，得菌絲體和上清液；將上清液減壓濃縮或常壓蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度不超過100 ℃，得黏稠狀液體；濃縮液加入2 倍體積的95%的乙醇醇析，其醇析時間不低于24 h，獲得白色纖維狀沉淀；將沉淀離心，沉淀用75%的乙醇洗滌數(shù)次；在60 ℃烘干，得灰白色粗多糖。

1.4.2.2 粗多糖的測定

將經(jīng)干燥至恒重的粗多糖直接用分析天平稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以4 種不同培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基時，冬蟲夏草在培養(yǎng)過程中生物量和胞外多糖隨時間變化的曲線如圖1 所示，從圖1（a）中可知，冬蟲夏草在以培養(yǎng)基（A）作為發(fā)酵培養(yǎng)基時細(xì)胞生長要好于其它3 種培養(yǎng)基，獲得最大細(xì)胞干重為18.56 g/L。胞外多糖隨時間變化曲線如圖1（b）所示，從圖1（b）中可知，冬蟲夏草在以培養(yǎng)基（A）作為發(fā)酵培養(yǎng)基時獲得了最大胞外多糖產(chǎn)量1.89 g/L，胞外多糖產(chǎn)量明顯高于其它3 種培養(yǎng)基。綜合考慮菌體量和胞外多糖產(chǎn)量，以培養(yǎng)基（A）做為冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵的初始培養(yǎng)基。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.1 Effects of fermentation mediums on cell growth and EPS production in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響

圖2 碳源對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.2 Effects of carbon source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks.

冬蟲夏草細(xì)胞生長的動態(tài)變化過程如圖2（a）所示，當(dāng)以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖為初始碳源時獲得 最 大 細(xì) 胞 干 重 分 別 為17.405、17.015、10.870 和16.025 g/L，結(jié)果表明以葡萄糖為初始碳源時獲得的細(xì)胞干重最大，乳糖獲得的細(xì)胞干重最小。冬蟲夏草胞外多糖生產(chǎn)的動態(tài)過程如圖2（b）所示，當(dāng)以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖為初始碳源時獲得最大胞外多糖產(chǎn)量分別為1.82、1.66、1.564 和1.96 g/L，從圖中可知麥芽糖最有利于胞外多糖生產(chǎn)，葡萄糖次之。72 h 之前，胞外多糖與細(xì)胞生長呈一定的相關(guān)性，隨著菌體細(xì)胞生長，胞外多糖也相應(yīng)增加72 h 以后，細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)有一定的背離（乳糖例外）。雖然麥芽糖最有利于胞外多糖生產(chǎn)，但是使用麥芽糖做碳源，成本太高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適碳源為葡萄糖。

2.2.2 葡萄糖起始濃度對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響

葡萄糖起始濃度對蟲草菌細(xì)胞生長的影響如圖3（a）所示。當(dāng)葡萄糖起始濃度為10、20、30、40 g/L 時，獲得的細(xì)胞干重分別是14.05、19.23、21.68、20.52 g/L。相應(yīng)的細(xì)胞平均生長速率分別為2.299、3.163、3.613、3.420 g/（L·d）。結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖起始濃度為30 g/L時獲得了最大的細(xì)胞干重21.68 g/L 和細(xì)胞平均生長速率3.613 g/（L·d）。葡萄糖起始濃度對冬蟲夏草胞外多糖生產(chǎn)的影響如圖3（b）所示。當(dāng)葡萄糖起始濃度為10、20、30、40 g/L 時，獲得最大胞外多糖產(chǎn)量分別為1.301、1.840、2.054、2.174 g/L。

圖3 葡萄糖起始濃度對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of initial glucose concentration，i.e.10，20，30，40 g/L on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適葡萄糖起始濃度為30 g/L。

2.2.3 氮源對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響

圖4 氮源對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

冬蟲夏草細(xì)胞生長的動態(tài)變化過程如圖4（a）所示，在起始氮源分別為蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸銨時，獲得了最大的細(xì)胞干重，分別為23.10、22.25、21.28、16.12 g/L。從圖中可知以蛋白胨為氮源時獲得了最大的細(xì)胞干重23.10 g/L，以硫酸銨為氮源時獲得的細(xì)胞干重最小16.12 g/L。從圖4（a）中可知在培養(yǎng)前期以硫酸銨為氮源時菌體生長要快于其它3 種有機(jī)氮源，這是因為微生物對無機(jī)氮源的利用一般比有機(jī)氮源快[8]。但是培養(yǎng)到72 h 后其它3 種有機(jī)氮源的細(xì)胞生長要明顯快于硫酸銨，這是因為有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，往往還含有少量的糖類，脂肪，無機(jī)鹽，維生素及某些生長因子，尤其是其中的某些生長因子可能會促進(jìn)菌體細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物合成。冬蟲夏草胞外多糖生產(chǎn)的動態(tài)過程如圖4（b）所示，在起始氮源分別為蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸銨時，獲得了最大胞外多糖產(chǎn)量分別為2.230、1.522、1.558、1.074 g/L。當(dāng)以蛋白胨為氮源時獲得的胞外多糖產(chǎn)量最大2.230 g/L，以硫酸銨為氮源時獲得的胞外多糖產(chǎn)量最小1.074 g/L，這可能是蛋白胨中含有的某些生長因子有利于胞外多糖的生產(chǎn)。

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適氮源為蛋白胨。

2.2.4 蛋白胨起始濃度對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響

蛋白胨起始濃度對冬蟲夏草細(xì)胞生長的影響如圖5（a）所示，當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛葹?、10、15 g/L 和20 g/L 時，獲得的最大細(xì)胞干重分別為18.800、22.840、24.995 和23.795 g/L。結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛?5 g/L 時獲得了最大細(xì)胞干重，起始濃度5 g/L 時獲得的細(xì)胞干重最小。蛋白胨起始濃度對冬蟲夏草胞外多糖生產(chǎn)的影響如圖5（b）所示，當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛葹?、10、15 g/L 和20 g/L 時，獲得的最大胞外多糖產(chǎn)量分別為2.069、2.338、2.802 和2.796 g/L。結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛?5 g/L 時更有利于冬蟲夏草胞外多糖的生產(chǎn)。

圖5 蛋白胨起始濃度對冬蟲夏草細(xì)胞生長和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of initial peptone concentration,i.e.5，10，15，20 g/L on cell growth（c）and EPS production（d）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量。以15 g/L作為發(fā)酵培養(yǎng)基的起始氮源濃度。

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定冬蟲夏草液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖30 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4.7H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶培養(yǎng)條件下，獲得的最大生物量和最大胞外多糖產(chǎn)量分別為24.99 g/L 和2.80 g/L，比優(yōu)化前分別提高了34.6%和48.1%。

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