付金容，林國(guó)生，武智曉

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)三科，武漢湖北430060）

·論著·

缺血再灌注心肌中補(bǔ)體C3的表達(dá)與補(bǔ)體C1抑制劑的心肌保護(hù)作用

付金容，林國(guó)生，武智曉

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)三科，武漢湖北430060）

目的研究缺血再灌注心肌中補(bǔ)體C3的表達(dá)以及補(bǔ)體1抑制劑（C1INH，C1 inhibitor）對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。方法結(jié)扎大鼠的冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，再灌注3 h、72 h造成缺血再灌損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、NaCl組和C1INH組（每組5只大鼠，n=5），觀察C1INH對(duì)大鼠心功能、心肌梗死面積的影響，同時(shí)采用免疫組化和Western blot法檢測(cè)缺血心肌補(bǔ)體C3的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，再灌注3 h及72 h后，NaCl組和C1INH組鼠心功能下降，心肌的梗死面積增加，缺血心肌補(bǔ)體C3的表達(dá)增加。與NaCl組比較，再灌注72 h后，C1INH組心功能改善，心肌的梗死面積減少[（36.28±0.99）%vs（50.58±0.24）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，C1INH組缺血心肌補(bǔ)體C3的表達(dá)減少。結(jié)論C1INH通過抑制缺血心肌補(bǔ)體C3的表達(dá)而減少缺血再灌所致的心肌損傷，改善心功能。

補(bǔ)體1抑制劑；缺血再灌注；補(bǔ)體C3

恢復(fù)缺血心肌的灌注是挽救心肌的一項(xiàng)必要措施，越來越多的證據(jù)表明再灌注本身會(huì)導(dǎo)致心肌的額外損傷[1]。補(bǔ)體1抑制劑(C1INH，C1inhibitor)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，它調(diào)節(jié)三條補(bǔ)體途徑的激活。C1INH抑制補(bǔ)體的激活是保護(hù)缺血心肌細(xì)胞減少再灌注損傷的一條有效途徑。

我們建立大鼠缺血再灌注模型，研究了靜脈注射C1INH后，大鼠心功能的變化和心肌梗死面積的變化，以及缺血心肌中補(bǔ)體C3表達(dá)的變化，探討C1INH對(duì)缺血再灌注心肌的作用及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 大鼠缺血再灌模型的制備及分組SD大鼠(200～250 g，雌雄不限，8周齡)購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。以穿線結(jié)扎法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支30 min造成心肌缺血，松開結(jié)扎導(dǎo)致再灌注；常規(guī)心電圖監(jiān)測(cè)心肌缺血變化，以結(jié)扎后ST段抬高、松扎后ST段下降1/3以上者為合格模型。再灌注3 h和72 h后，麻醉大鼠(100 mg/kg ketamine，1.5 mg/kg xylazine)進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖分析(8 mHz探頭，VIVID7，GE，USA)；然后用多導(dǎo)生理儀(Lead 2000，B型，錦江通用有限公司，四川)進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為以下幾組：(1)假手術(shù)組(n=5)；(2)NaCl組(缺血30 min，再灌注3 h或72 h)，于術(shù)前5 min靜脈注射0.9%NaCl(10 ml/kg)溶液(I/R，n=5)；(3)C1INH組(缺血30 min，再灌注3 h或72 h)，于術(shù)前5 min靜脈注射C1INH(40 U/kg，1 U≈0.15 mg，Behring公司，Germa-ny)溶液(I/R+C1INH，n=5)

1.2 心肌梗死面積的測(cè)定再灌注結(jié)束后，將大鼠的左前降支再次結(jié)扎，并從肺動(dòng)脈注射l ml的伊文氏蘭(1%，Sigma)，待缺血區(qū)顯示清晰后，迅速取出心臟，快速用冷卻生理鹽水沖洗后減去心房及右心室，-20℃冷凍10 min，將左心室橫切成2 mm厚的薄片。將未染色的心肌(缺血心肌)與染色心肌(未缺血心肌)區(qū)分離出來，放入1%2,3,5-氧化三本基四氮唑(TTC)中，37℃孵育15 min，未梗塞組織呈磚紅色，梗塞組織呈灰白色，根據(jù)顏色的差別將它們分離開來。最后將左心室這三部分組織(即未缺血心肌、缺血但成活心肌和缺血并壞死心肌)分別稱重，計(jì)算出梗塞區(qū)(Myocardial infarct size，MIS)占缺血面積(Area of risk，AR)的比例。

1.3 心肌組織補(bǔ)體C3、的免疫組化分析將取自缺血心肌的石蠟切片脫蠟及抗原修復(fù)，PBS沖洗后，加3 ml/L過氧化氫處理10 min；再以PBS沖洗后，依次滴加正常羊血清(室溫30 min)、小鼠單克隆抗體C3(200 g/ml，1:50)(37℃孵育60 min，PBS洗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG(1:40)(37℃孵育30 min，PBS洗)，最后封片顯微鏡下觀察。一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司、二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.4 Western blot檢測(cè)缺血心肌補(bǔ)體C3的含量取左心室游離壁的組織，100 mg心肌組織放入1 ml裂解液，冰上充分勻漿后，4℃離心，取上清，Lowry法測(cè)定蛋白濃度，并將總蛋白濃度調(diào)至大約為50μg/15μl。取15μl蛋白溶液加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸10 min，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下用封閉液封閉1 h，然后與小鼠抗大鼠C3單克隆抗體(Santa Cruz公司生產(chǎn))4℃下孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG和抗山羊IgG(美國(guó)KPL公司)室溫下孵育1 h。洗膜后加入ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)1 min，立即用Kodak底片曝光，洗片后經(jīng)凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描，應(yīng)用圖像分析軟件(Vilber Lourmat公司，德國(guó))分析，以各組心肌細(xì)胞內(nèi)的β-actin含量作為標(biāo)準(zhǔn)來確定X光片上C3的相對(duì)含量。封閉液、ECL試劑均采用KPL公司生產(chǎn)的Western blot試劑盒。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.0軟件分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單變量配對(duì)資料之間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 C1INH改善大鼠缺血再灌后心功能、減少心肌梗死面積隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮壓(LVSP)、左室壓差(LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dt max)均顯著下降，左室舒張末壓(LVEDP)則顯著增高(表1)。再灌注72 h時(shí)，與NaCl組比較，C1INH治療組大鼠的心功能得到明顯改善(表1)，心肌梗死面積顯著減少(表2)。

表1 C1INH對(duì)缺血再灌注大鼠心功能的影響

表1 C1INH對(duì)缺血再灌注大鼠心功能的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與NaCl組比較，bP＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa。

表2 C1INH對(duì)心肌梗死面積的影響

表2 C1INH對(duì)心肌梗死面積的影響

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與NaCl組比較，bP＜0.05。

2.2 C1INH抑制心肌細(xì)胞補(bǔ)體C3的蛋白表達(dá)

2.2.1 免疫組化法顯示補(bǔ)體C3在心肌的表達(dá)免疫組化分析顯示，缺血再灌后3 h，心肌細(xì)胞上可見補(bǔ)體C3的表達(dá)，而正常大鼠心肌則未見表達(dá)。缺血再灌注后72 h，補(bǔ)體C3的表達(dá)減少(圖1)。

2.2.2 Western blot顯示補(bǔ)體C3在心肌的含量Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化的結(jié)果，C1INH能減少再灌3 h及72 h心肌補(bǔ)體C3的表達(dá)量(圖2)。

圖1 C1INH對(duì)缺血心肌組織中C3蛋白表達(dá)的影響(HE×400)

圖2 C1INH對(duì)缺血心肌組織中C3蛋白含量的影響

3 討論

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了C1INH對(duì)缺血再灌心肌的保護(hù)作用。首先，C1INH可減少心肌梗死面積、改善心功能；其次C1INH還抑制缺血心肌C3的蛋白表達(dá)。

補(bǔ)體的激活參與了再灌注損傷，抑制補(bǔ)體的激活則可減少缺血再灌注損傷：梗死心肌中檢測(cè)到補(bǔ)體的表達(dá)(如C1q、C3、C4和C5)，敲出小鼠補(bǔ)體C3基因則可減少其缺血再灌損傷[2]，耗竭激活的補(bǔ)體(如眼鏡蛇蛇毒因子)或抑制補(bǔ)體的激活(如可溶性補(bǔ)體C1受體)均可減輕缺血心肌細(xì)胞的損傷。

這些證據(jù)表明補(bǔ)體的激活在缺血再灌損傷中起著重要作用，抑制補(bǔ)體途徑的激活可挽救受損組織。我們的研究結(jié)果顯示，在手術(shù)前5 min給予C1INH，可顯著減少心肌的再灌注損傷。再灌注3 h時(shí)，C1INH組大鼠心功能并沒有明顯改善(如EF、FS、LVDP和dp/dt max)。但隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，再灌注72 h時(shí)，與Nacl組比較，C1INH組大鼠的心功能則明顯改善，而此時(shí)C1INH組大鼠心肌的梗死面積也顯著減少。因此，C1INH治療有助于減輕缺血再灌注損傷。

缺血再灌注中存在著三條補(bǔ)體激活途徑，補(bǔ)體C3是體內(nèi)含量最多的補(bǔ)體蛋白，它在補(bǔ)體激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著中樞作用。補(bǔ)體激活產(chǎn)生具有趨化活性、過敏毒素性質(zhì)或免疫調(diào)節(jié)活性的片段，而三條補(bǔ)體途徑的激活均要通過C3的裂解。正常條件下C3主要由肝臟產(chǎn)生，但缺血再灌后的心肌也能合成大量的C3。C3在局部組織的合成也可能參與了缺血再灌注損傷[3]。C3a為過敏毒素，C3a產(chǎn)生依賴C3的裂解。因此對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，最理想的措施還是對(duì)C3或C3a的調(diào)節(jié)[4]，C1INH能抑制血液中C3a和C5a的增加。我們研究了C1INH對(duì)缺血心肌中關(guān)鍵補(bǔ)體蛋白C3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示再灌注會(huì)導(dǎo)致心肌中C3的表達(dá)，C1INH能夠抑制這種表達(dá)。

綜上所述，C1INH可保護(hù)缺血心肌，改善心功能，而這種保護(hù)作用可能與其抑制補(bǔ)體的激活，抑制細(xì)胞因子(如TNF-a)的釋放、粘附分子的表達(dá)以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)；缺血心肌組織中的補(bǔ)體成分C3參與了缺血再灌注損傷，C1INH可抑制缺血心肌C3的表達(dá)而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。

[1]王苗,梁偉鈞.他汀類對(duì)缺血再灌注心肌保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué),2012,23(6):119-122．

[2]Bjerre M,Hansen TK,Flyvbjerg A.Complement activation and cardiovascular disease[J].Horm Metab Res,2008,40(9):626-634.

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Expression of C3 in ischemic reperfused myocardium and the role of C1 inhibitor.

FU Jin-rong,LIN Guo-sheng, WU Zhi-xiao.The Third Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of C3 in ischemic reperfused myocardium and the protective effect of C1 inhibitor(C1INH)on ischemic myocardium.MethodsRat heart ischemia/reperfusion injury was induced by occluding the left anterior descending coronary artery for 30 min and reperfusion for 3 h or 72 h.C1 inhibitor or NaCl was administrated intravenously 5 min before surgery.The rats were divided into three groups,the false surgery group,the NaCl group and the C1INH group,each with 5 cases.The effect of C1INH on cardiac function and infarct size was measured,and the expression of C3 in ischemic myocardium was detected by immunohistochemistry and western blot.Results3 h and 72 h after reperfusion,the NaCl group and the C1INH group had worsened cardiac function and increased infarct size,as well as increased expression of C3,compared with the false surgery group.72 h after reperfusion,the C1INH group had significantly improved cardiac function and significantly reduced infarct size [(36.28±0.99)%vs(50.58±0.24)%],compared with the NaCl group(P＜0.05),as well as suppressed expression of C3.ConclusionC1INH protects against I/R-induced myocardial injury via inhibition of C3 protein expression in ischemic myocardium.

C1 inhibitor,Ischemia and Reperfusion,Complement C3

R-332

A

1003—6350(2013)01—0006—03

2012-06-13)

付金容。E-mail：whfujinrong@yahoo.com.cn