黃平，唐秋英，金瑛，陳光元

（深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳518105）

·論著·

Bcl-2蛋白在宮頸癌變組織中的表達及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)聯(lián)性

黃平，唐秋英，金瑛，陳光元

（深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳518105）

目的基于宮頸癌發(fā)病的病毒學(xué)原因，探討B(tài)cl-2基因在宮頸癌中的表達及其與人乳頭瘤病毒感染的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2蛋白在30例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、20例宮頸癌及20例正常宮頸組織中的表達。采用PCR技術(shù)檢測上述標本中HPV16/18DNA的表達。結(jié)果Bcl-2蛋白在CIN中的表達率為40%，宮頸癌中為70%，正常宮頸中表達為5%。HPV16/18在上述組織中的表達率依次為50%、75%、5%。Bcl-2蛋白和HPV16/18DNA在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的表達兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；Bcl-2蛋白在CINⅠ/Ⅱ及CINⅢ中的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義，但與宮頸癌病理類型及分化和臨床分期無關(guān)。結(jié)論Bcl-2及HPV16/18參與了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，聯(lián)合檢查HPV16/18和Bcl-2有望為宮頸癌的臨床早期診斷和治療提供理論依據(jù)。

宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌；Bcl-2基因

宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)，宮頸癌組織中HPV陽性率達95%，而其中高危型HPV16/18占了約60%以上[1]。而目前公認的HPV16/18感染參與正常宮頸組織-CIN-宮頸癌發(fā)病的機制為：HPV病毒整合于宿主基因組，其中的E6、E7蛋白可使癌基因激活、抑癌基因失活及抗凋亡基因過度表達，從而導(dǎo)致細胞的惡性生物學(xué)行為[2]。Bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因。本研究采用免疫組織化學(xué)法和原位雜交法檢測Bcl-2基因和HPV16/18DNA在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達，探討B(tài)cl-2基因在宮頸癌病變過程中的作用及其與HPV16/18感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇我院2011年1月至2012年5月間經(jīng)病理科診斷的宮頸病變組織切片50例，包括宮頸鱗癌14例、腺癌6例，CINⅠ～Ⅱ15例及CINⅢ15例，以及20名正常宮頸組織做對照。根據(jù)最新FIGO分期進行臨床分期：Ⅰ～Ⅱa期16例，Ⅱb～Ⅲ期4例。病理學(xué)分級：高中分化6例，低分化14例。取材前均未接受任何治療。

1.2 方法

1.2.1 Bcl-2蛋白檢測采用免疫組化鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和免疫組化試劑盒(購自東盛生物有限公司)，嚴格按照試劑盒操作說明進行。結(jié)果判斷：細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bcl-22陽性，高倍鏡下隨機觀察10個視野，記錄陽性細胞百分比，＜10%為陰性，＞10%為陽性。

1.2.2 HPV16/18DNAPCR的檢測按照Baay等[3]的文章設(shè)計HPV16、18型特異性引物并送公司合成。脫蠟水化，經(jīng)蛋白酶K消化。取10 μl標本加入100 μl PCR體系。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性8 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)。最后72℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在395 bp、116 bp處出現(xiàn)條帶為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法樣本率差異比較采用卡方檢驗及Fisher精確概率法，兩者相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。采用SPSS13.0軟件，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2蛋白和HPV16/18DNA在不同宮頸組織中的表達Bcl-2蛋白陽性定位主要在胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。Bcl-2在正常宮頸組織中的陽性表達率為5%(1/20)，在CIN中為40%(12/30)，而在宮頸癌中高達70%(14/20)。在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的表達呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢，且在CINⅢ中表達高于CINⅠ和CINⅡ。同樣，HPV 16/18在上述三種組織中逐漸增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，HPV陽性率與臨床分期、病理類型無關(guān)，見表1。

表1 不同臨床病理特征的宮頸組織Bcl-2基因和HPV16/18陽性表達情況

2.2 Bcl-2表達與HPV16/18感染的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，宮頸癌組織Bcl-2蛋白表達與HPV16/18感染具有正相關(guān)性，r=0.864，P＜0.000，見表2。

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3 討論

Bcl-2基因是最早在B細胞白血病和濾泡型淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡抑制基因，定位于染色體18q21，由于t(14;18)染色體易位以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致Bcl-2蛋白過度表達[4]。隨后研究報道，Bcl-2的過度表達除了與淋巴造血組織腫瘤相關(guān)外，在非淋巴造血組織腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。有研究[5]結(jié)果顯示Bcl-2基因在CINⅢ級中的表達明顯高于CINⅠ級和CINⅡ級，提示Bcl-2基因的過表達可能與癌前病變的發(fā)生即鱗狀上皮進一步分化失敗有關(guān)，是宮頸癌發(fā)生的早期事件。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Bcl-2在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌組織中表達逐漸增強，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這就提示Bcl-2的過表達不僅是宮頸癌發(fā)病的早期事件，其也參與了宮頸癌病變的發(fā)展。

Bcl-2基因抑制凋亡或者程序性細胞死亡的作用是肯定的，Bcl-2基因的過度表達能夠阻止或者減少不同刺激如化療藥物、射線等對細胞的殺傷作用，從而使得表達Bcl-2的腫瘤包括宮頸癌對放化療不敏感與其不良預(yù)后有關(guān)[6]。然而很多關(guān)于不同腫瘤類型的研究也表明表達Bcl-2蛋白的腫瘤患者較Bcl-2陰性患者手術(shù)治療后的預(yù)后要好，這可能與Bcl-2對細胞周期的抑制作用有關(guān)[7]。目前為止共有7項研究報道接受手術(shù)治療的宮頸癌患者的預(yù)后與Bcl-2的關(guān)系，其中僅有Dimitrakakis等[8]的一項研究中的患者接受手術(shù)治療，而其他六項研究中的患者同時接受了適當(dāng)?shù)姆暖熁蛘呋?。Dimitrakakis等[8]發(fā)現(xiàn)表達Bcl-2的宮頸癌患者術(shù)后5年存活率明顯高于Bcl-2陰性患者，分別為74%和49%。國內(nèi)齊榮義等[9]研究也有此發(fā)現(xiàn)。我們研究結(jié)果也顯示：Bcl-2在分化較好的宮頸鱗癌中陽性表達率有增高趨勢，然而必須注意的是，這種分析并不涉及其他一些重要的預(yù)后因素如腫瘤分級、侵潤深度及有無淋巴轉(zhuǎn)移等，因此，Bcl-2對宮頸癌的預(yù)后價值尚需進一步探討。

宮頸癌由良性病變發(fā)展到CIN及CIN進一步發(fā)展到癌是一個連續(xù)過程，雖然部分CIN可逆轉(zhuǎn)，但CIN發(fā)展至癌的過程中與高危因素的存在也是密不可分的。高危型HPV感染與宮頸癌的臨床進展和預(yù)后密切相關(guān)[10]。高危型HPV主要為HPV16/18亞型，可導(dǎo)致CINⅡ、CINⅢ級病變及宮頸癌的發(fā)生。我們的研究結(jié)果顯示：在正常宮頸中HPV16/18的感染率為5%，CIN中為50%，其中CINⅢ級中為60%，宮頸癌中為80%，三者感染率逐漸升高，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。這就意味著宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與高危型HPV16/18有關(guān)，總的來說，臨床上積極預(yù)防和治療HPV感染還是有重要意義的。

總之，宮頸癌的發(fā)生是遺傳背景下多種因素相互作用的結(jié)果，HPV感染、抗凋亡基因過表達等共同調(diào)節(jié)著其發(fā)生，聯(lián)合Bcl-2基因、HPV16/18DNA檢測有望為宮頸癌的診斷治療及預(yù)后提供有價值的參考。

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Expression of Bcl-2 protein in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma and its correlation with HPV16/18 infection.

HUNAG Ping,TANG Qiu-ying,JIN Ying,CHEN Guang-yuan.Department of Obstetric and Gynecology,Songgang People's Hospital of Baoan District of Shenzhen City,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Bcl-2 protein in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia,and to analyze the correlation between expression of Bcl-2 protein with HPV16/18 infection.MethodsWith immunohistochemiacal method,the expression of Bcl-2 protein was detected in 30 cases of cervical intraepithelial neoplasia(CIN),20 cases of cervical carcinoma and 20 cases of normal cervical tissues.Also,the HPV16/18 DNA was detected by PCR.ResultsThe positive rates of Bcl-2 protein in the above three tissues were 40%,70%and 5%,respectively,while the percentages of HPV16/18 infection were 50%,75%,and 5%,respectively, both with statistically significant difference in the three tissues.The expression of Bcl-2 was related with the grade of CIN rather than clinical pathological type and clinical stage.ConclusionBcl-2 and HPV16/18 may take part in the occurrence and development of cervical carcinoma.It would be useful to detect the Bcl-2 and HPV16/18 in the early diagnosis and treatment for cervical carcinoma.

Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Cervical carcinoma;Bcl-2

R737.33

A

1003—6350(2013)01—0003—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.01.0002

2012-05-12)

2010年度深圳市科技計劃項目（編號：201003382）

黃平。E-mail：youping77731@yahoo.com.cn