鄭旭銳 樊英華 韋永紅 宋 健 曹 寧 王禮鳳 應(yīng)小平 惠 毅

陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽712046）

姜黃素（Curcumin，Cur）是從中藥姜黃中提取的一種酚類色素，其具有抗腫瘤、抗氧化、保肝等廣泛的藥理作用，本實驗觀察姜黃素對肝星狀細胞（HSC－T6）JAK2－STAT3信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料 ①重組瘦素蛋白（為美國Protech公司生產(chǎn)）；②actin及化學(xué)發(fā)光試劑（購自北京中山公司）；③RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司生產(chǎn)）；④山羊抗兔二抗、JAK2、STAT3（均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司生產(chǎn)）；⑥HSC－T6（購自上?？蠌妰x器有限公司）。

1.2 實驗方法 1.2.1 細胞培養(yǎng)方法：培養(yǎng)基：RPMI－1640＋10%胎牛血清。培養(yǎng)液：37.0C carbon dioxide（CO2），5%。①棄去培養(yǎng)液，用PBS（不含鈣，鎂離子）洗1～2次；②加1mL消化液（0.25%Trypsin－0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1～3min預(yù)熱，然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30s后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓分散，輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，細胞隨即脫落下來；③加入6～8mL完全培養(yǎng)基，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中。每2d傳代1次。

1.2.2 制備藥物血清：姜黃素（購自Sigma公司）；秋水仙堿：西雙版納制藥廠生產(chǎn)（批號：C－2284）。Wistar大鼠36 只，雄性，體重180g±20g，清潔級，均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

將動物按隨機數(shù)字表法隨機分為3組：正常（A）組、姜黃素（B）組、秋水仙堿（C）組，每組均12只大鼠。①A 組給予相應(yīng)劑量生理鹽水灌胃；②其余2組每日均按1mL／100g藥液經(jīng)胃灌藥1次。以上各組大鼠均采用連續(xù)灌胃7d的方法。

1.2.3 取材方法：①將各實驗組大鼠禁食不禁水12h，在最后一次灌藥1h后，每只大鼠（按0.35mL／100g的劑量）用含10%水合氯醛進行麻醉；②麻醉成功后每組動物進行心臟采血（2mL／只）；③用3000r／分的離心機離心分離血清；④在56℃水浴中滅活30min；⑤用0.44um 微孔濾膜過濾后冷藏－20℃冰箱中以備后用。

1.2.4 蛋白印跡試驗：按試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素組含藥血清對肝星狀細胞JAK2蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組6h、12、24h時間段的蛋白條帶顏色均變淺，而且在12h的蛋白條帶顏色最淺。見圖1。

圖1 1～4分別表示姜黃素組0，6，12，24h的蛋白條帶顏色

2.2 作用6h后，各組含藥血清對增殖后的肝星狀細胞中JAK2蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組、秋水仙堿組蛋白條帶顏色均變淺，而姜黃素組蛋白條帶顏色與秋水仙堿組比較則未見明顯差異（圖2）。

圖2 姜黃素對增殖后的肝星狀細胞的JAK2表達的影響結(jié)果

2.3 姜黃素對肝星狀細胞STAT3蛋白表達影響 與正常血清組比較，姜黃素藥物血清作用6h后，蛋白條帶顏色開始逐漸變淺，STAT3表達水平逐漸降低，至24h顏色最淺，表明STAT3蛋白表達水平達到最低（圖3）。

圖3 1～4分別表示姜黃素0，6，12，24h的蛋白條帶顏色

2.4 作用12h后，各組含藥血清對增殖后的肝星狀細胞中STAT3蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組、秋水仙堿組蛋白條帶顏色變淺，而姜黃素組與秋水仙堿組比較則無明顯差異（圖4）。

圖4 姜黃素對增殖后的肝星狀細胞STAT3表達的影響結(jié)果

3 討 論

肝星狀細胞（HSC）的激活是導(dǎo)致肝纖維化的一個共同的途徑，其共有的表現(xiàn)是HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，合成大量的細胞外基質(zhì)（ECM），ECM 在肝臟內(nèi)大量的沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成，故現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為肝纖維化發(fā)生的細胞學(xué)基礎(chǔ)是HSC的活化與增殖［1］。人HSC 活化增殖時Ⅰ型膠原mRNA為靜止時的60～70倍［2］，HSC活化增殖，膠原合成增加是肝纖維化形成的直接原因。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)瘦素是促肝纖維化細胞因子，它是肥胖基因編碼的一種肽類激素，其具有顯著誘導(dǎo)HSC 活化和增殖的作用［3］?，F(xiàn)有研究表明，HSC 內(nèi)瘦素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要涉及到JAR－STAT（Janos激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子）途徑，JAR－STAT 途徑僅由JARs和STATs兩級信號傳遞組分構(gòu)成，當瘦素與其受體結(jié)合后，激活JAK 激酶，JAK 酪氨酸磷酸化后與磷酸化受體進一步結(jié)合，從而使下游胞漿蛋白STAT 磷酸化，STAT 磷酸化后轉(zhuǎn)入核內(nèi)，識別并結(jié)合到啟動因子區(qū)瘦素的活化序列或相關(guān)序列，調(diào)控瘦素的基因轉(zhuǎn)錄［4，5］。

姜黃素（curcumin，cur）是從中藥姜黃根莖中提取的一種天然有效成分，其具有抗氧化、抗病毒、保肝等廣泛的藥理作用［6］。我們對于姜黃素的前期研究已經(jīng)做了姜黃素對于肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ－C含量及肝組織TGFβ1的影響的研究以及姜黃素治療慢性乙型肝炎肝纖維化臨床療效觀察，證明其有較好的抗肝纖維化的作用［7－10］。

本次研究結(jié)果顯示：姜黃素能降低肝星狀細胞中JAK2、STAT3蛋白的表達，阻斷JAK2－STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，說明姜黃素可能是通過降低JAK2、STAT3 蛋白表達，阻斷JAK2－STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)其抗肝纖維化作用的。

［1］ 董培紅，何生松，蘇 剛，等.內(nèi)毒素對大鼠肝星狀細胞活化和瘦素表達的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15（2）：156－158.

［2］ Efanvic B，Hellerbrand C，Holcik M，et al.Post transcriptional regulate on of collagen lpha（1）mRNA in hepatic stellate cells［J］.Mol Cell Biod，1997，17（9）：5201.

［3］ Saxena，TitusNK，DingXMA，et al.Leptinasanovelpro in hepatic stellate cells：mitogenesis byextracellular（Erk）and regulated Aktphosphorylatio kinase［J］.FASEBJ，2004，18（13）：1612－1614.

［4］ Kisseleva，BhattacharyaT，Braunstein，et al.Jsignalingthr otherSTAT pathway，recent advances and［J］.future－Ciene，2002，chal 285：1－24.

［5］ Ahima，F(xiàn)lierRS JS.Leptin ［J］.AnnuRev，2000Physiol，62（1）：413－437.

［6］ 李凱杰，胡錫敏.姜黃素抗肝纖維化機制的研究進展［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，2（8）：314－316.

［7］ 孫守才，宋 健，李長秦，等.姜黃素對于肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ－C含量及肝組織TGFβ1的影響的研究［J］.陜西中醫(yī)，2007，9（8）：1247－1249.

［8］ 張 航，孫守才，宋 健，等.姜黃素治療慢性乙型肝炎肝纖維化臨床療效觀察［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2007，5（27）：3－7.

［9］ 鄭旭銳，孫守才，李長秦，等.姜黃素對肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 影響的研究［J］.中藥材，2007，30（9）：1118－1119.

［10］ 鄭旭銳，張選國，宋 健，等.姜黃素對肝纖維化模型肝組織Ⅳ型膠原和轉(zhuǎn)化生長因子β1mRNA 表達的影響［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（6）：749－750.