方 瑜 楊柳青 陳光偉 陜西中醫(yī)學院（咸陽712046）

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見消化系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其起病較隱匿，進展迅速，惡性程度高，容易復發(fā)轉(zhuǎn)移，生存期較短，并有“癌中之王”之稱。近年來，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率呈上升趨勢［1］。根據(jù)最新統(tǒng)計，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。死亡率居第3 位［2］，我國是世界上肝癌的高發(fā)地區(qū)之一，目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球肝癌病人的50%以上［3］，已經(jīng)成為嚴重威脅我國人民健康和生命的一大殺手，其危險性不容小視。本實驗欲通過研究扶正抗癌方中VEGF和nm23在動物模型中的表達來探討其抗肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的可能機制。

1 材 料

1.1 瘤 株 H22腹水型肝癌瘤株，第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（軍2011－007）。

1.2 實驗動物 健康雌性KM 小鼠共85 只，1～1.5 月齡，體重18～22g，動物合格證號：SCXK（陜2011－003）。

1.3 實驗用藥 扶正抗癌方（FZKAF）由陜中附院制劑研究中心提供（由黃芪、靈芝、女貞子、莪術(shù)、山豆根、藤梨根各15g，白術(shù)、丹參、法半夏各12g為基礎方隨證加減），按成人體重60kg計算，20g小鼠每公斤體重生藥量折算為126g÷60kg×9.01×0.02kg＝0.378g，將FZKAF 配置成1.89g／mL 混懸液。對照藥替加氟（生產(chǎn)批號：20110305，50mg／片）研磨，按成人用量加蒸餾水配制成15mg／mL的混懸液。

1.4 主要試劑 北京博奧森生物工程有限公司生產(chǎn)的兔抗鼠VEGF 單克隆抗體（bs－1313R，0.2mL）；DAB 顯色劑（C－0003）；兔抗小鼠nm23 單克隆抗體（bs－0688R，0.1mL）；SP 免疫組化試劑盒（SP－9002；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2 方 法

2.1 操作方法 抽取接種7d的小鼠腹水，染色后計算活腫瘤細胞數(shù)并用生理鹽水稀釋成1×107／mL 的瘤細胞懸液。將瘤細胞懸液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接種造模。取15只健康小鼠作為A：空白對照組；再將造模成功的60只，分別分為B：荷瘤對照組；C：替加氟組；D：扶正抗癌方組；E 組：扶正抗癌方組＋替加氟組。A 組：0.9%生理鹽水，0.2mL／只／d灌胃；B組：0.9%生理鹽水，0.2mL／只／d灌胃；C 組：15mg／mL 替加氟稀釋液，0.2mL／只／d 灌胃；D 組：1.89g／mL 中藥煎劑，0.2mL／只／d灌胃；連續(xù)14d用藥。E 組：濃度為3.78g／mL 中藥煎劑0.1mL，濃度為30mg／mL 替加氟溶液0.1mL／只，第1d、第7d采用兩藥共同灌胃，其他時間采用D 組用藥方法，用藥14d。小鼠于用藥后第15d脫臼處死。

2.2 計算胸腺、脾臟指數(shù)測瘤重 摘除小鼠胸腺、脾臟，稱重；剝離瘤體稱重，固定于10%的甲醛中。臟器指數(shù)和抑瘤率計算公式如下：臟器指數(shù)＝臟器的重量mg／小鼠的體重g。

2.3 免疫組化法測定VEGF 和nm23的表達 將腫瘤組織按免疫組化SP法常規(guī)進行檢測。VEGF 和nm23陽性表達為棕黃色，VEGF主要表達于肝癌細胞質(zhì)，nm23主要表達于癌旁肝細胞。用400倍光學顯微鏡觀察，每例隨機觀察5個視野，選擇不少于100個細胞為準，計算陽性細胞數(shù)。陽性表達率＝表達陽性細胞數(shù)／總細胞數(shù)×100%。

3 結(jié) 果

3.1 各組藥物對荷瘤小鼠免疫功能的影響 見表1。

表1 各組藥物對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響

3.2 各組小鼠癌組織中VEGF 和nm23的表達情況及瘤重比較 見表2。

表2 各組藥物對H22荷瘤小鼠肝癌組織中VEGF和nm23的表達情況及瘤重比較

4 討 論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移首先依賴于血管的生成，VEGF 能特異地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管分裂增殖及新生血管的形成，并能增強血管通透性［4］，支持和促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。若沒有血管生成腫瘤直徑不會超過1mm，并將會壞死、凋亡，更不會發(fā)生轉(zhuǎn)移［5］，正常人體沒有或僅有很低水平的VEGF 表達，而大多數(shù)腫瘤均高度表達以支持其生長及轉(zhuǎn)移。研究證實腫瘤血管形成是HCC 侵襲轉(zhuǎn)移的關鍵。在98例原發(fā)性肝癌患者和40例健康志愿者的血清中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者血清VEGF水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），患者血清VEGF的表達水平與患者與腫瘤的組織學分級、浸潤深度、轉(zhuǎn)移密切相關（P＜0.01）。證實VEGF與原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移和浸潤有密切相關性［6］。本實驗結(jié)果顯示，VEGF 在荷瘤組小鼠肝癌組織中明顯高表達，在用藥組表達均降低（P＜0.05），說明用藥物可以降低VEGF在肝癌組織中的表達，其中聯(lián)合用藥組最為明顯（P＜0.01）。nm23基因是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)nm23的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系［7］，其作用機理如下：①通過催化GTP→GDP的轉(zhuǎn)化參與微蛋白的聚合與解體，改變細胞的黏附運動能力。②通過調(diào)節(jié)GDP合成參與G 蛋白調(diào)控的跨膜信息傳遞，從而對細胞的分化和癌基因的轉(zhuǎn)化起作用。nm23基因的表達水平與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移呈負相關［8］。羅洪英等［9］研究的結(jié)果顯示，nm23蛋白的表達強度與肝癌的分化有明顯的相關性，肝癌分化程度越低，其nm23蛋白的表達越弱，有轉(zhuǎn)移組的nm23蛋白表達水平顯著低于無轉(zhuǎn)移組，本實驗顯示，在小鼠癌旁組織中，荷瘤組nm23蛋白表達降低，用藥組nm23的表達均升高（P＜0.05），說明用藥物可以提高抑癌基因nm23的表達，其中以聯(lián)合用藥組最為明顯（P＜0.01）。本試驗顯示二指標不具有相關性，可能的機制為：VEGF 高表達是腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期基因改變，是腫瘤進入血管期后發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移的限速步驟［10］，而nm23－H1表達下降是腫瘤發(fā)展的后期基因改變，二者在時間上有差異性。在腫瘤晚期VEGF表達的升高和nm23－H1表達的降低可能共同促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

用藥組都有抗腫瘤生長的作用（P＜0.01），其中扶正抗癌方能夠提高機體免疫功能，激發(fā)機體抗腫瘤免疫效應，遏止腫瘤的生長、播散，夠改善小鼠的一般狀況、提高小鼠的生活質(zhì)量；而替加氟在殺傷腫瘤細胞的同時，小鼠體重下降，活動能力差，免疫功能損傷明顯。聯(lián)合用藥組在抑瘤率和VEGF、nm23的表達方面優(yōu)于單純用藥組，說明在化療過程中同時使用抗癌中藥具有減毒增效的作用。肝癌的發(fā)病是由正氣虧虛，邪毒乘虛而入，肝臟氣機失調(diào)，氣滯血瘀，痰濕內(nèi)盛，各種病理產(chǎn)物相互積聚于肝臟而成。其形成之后，又進一步耗傷氣血，日久因病致虛，使正氣更虛，而癌癥本身“邪氣”較盛，正虛不勝邪而致癌瘤在體內(nèi)惡化、擴散、轉(zhuǎn)移。扶正抗癌方是正是針對肝癌病機，以“扶正祛邪”為總則，通過本次實驗說明該中藥抗肝癌的機理可能與降低VEGF和提高nm23的表達抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移及提高小鼠免疫功能有關。

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