宋曉蕓，馬偉超

(天水師范學院 生命科學與化學學院，甘肅 天水741001)

0 引 言

在傳統(tǒng)的高校分子生物學實驗教學中［1］，學生單純按照課本上的實驗步驟進行實驗操作，缺乏獨立思考的過程。同時，由于各實驗的獨立性比較強，各實驗間的聯系性不強，學生進行的只是獨立的實驗，而缺少對實驗的整體認識，沒能形成整體的科研思路［2］。當前大多數院校開設的分子生物學實驗中，經常需要用到DNA 分離純化、PCR 擴增、割膠純化、感受態(tài)細胞制備、連接、轉化等基因克隆技術［3-4］，但大多實驗間缺少銜接，這不僅不利于學生對分子實驗的整體性掌握，也不利于培養(yǎng)學生嚴謹的實驗精神。因此，針對這一現狀，本文設計了一個在大腸桿菌中表達植物基因的綜合實驗，對高校分子生物學實驗教學模式的改革提供了思路。

擬南芥是常用的植物模板生物，其基因組大約為12 500 萬堿基對，且基因組已被測序。因此本試驗選用擬南芥為克隆基因的來源。為了降低實驗難度和保障實驗的重復性，本試驗選擇了一個不含內含子的基因PKS5(Salt Overly Sensitive2-Like Protein Kinase5)蛋白激酶作為克隆目標。擬南芥PKS5 蛋白激酶是PKS家族成員之一，包含435 個氨基酸，它在擬南芥抗高pH 及鹽堿中的信號轉導的過程中起重要作用［5］。

1 材料和方法

1.1 菌株及質粒

含質粒的大腸桿菌菌株(pUC19/Escherichia. coli DH5α、pGEX-6P-1/Escherichia.coli BL21)。

pUC19 質粒及pGEX-6p-1 質粒均由本實驗室保存。

1.2 菌株的培養(yǎng)與收集

將大腸桿菌接種到LB 平板上活化，37 ℃過夜培養(yǎng)。

從平板上挑取單菌落接種至液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過夜擴大培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

(1)CTAB，SDS，EDTA，D，L-2000marker，蛋白酶K，β-巰基乙醇，IPTG，SanPerp 柱式DNA 膠回收試劑盒(生工生物(上海)有限公司)，Protein MW Maker，T4DNA 連接酶，Taq 酶，BamHI、EcoRI 等酶(Takara 公司)。

(2)引物［6］。上游引物(PKS5GEXFBamHI):Cg g gAT CCA TgC CAg AgA TCg AgA TTg cc (BamHI 酶切位點)。下游引物(PKS5GEXFEcoRI):gg A ATT C TT AAA Tag CCg CgT TTg TTg(EcoRI 酶切位點)。引物由上海生工生物公司合成。

1.4 主要儀器

TGL-20M 型高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機有限公司)，Bio-Rad Gel2000 凝膠成像系統(tǒng)(美國biorad 公司)，DYY-4C 型電泳儀(北京市六一儀器廠)，電泳槽(北京市六一儀器廠)，金花牌移液器(北京青云卓立精密設備有限公司)，MG48 +型PCR 擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司)。

1.5 擬南芥基因組DNA 的提取方法(CTAB 法)

參照《精編分子生物學實驗指南》中的方法［7］，用液氮將植物組織粉碎成為細粉，然后將冷凍的組織轉移到2 ml 離心管中;往粉碎的組織中加入預熱的β-巰基乙醇/CTAB(4 g/ml)，混合使之充分濕潤，于65 ℃溫浴30 min，不時混勻;用等體積的氯仿/異戊醇(24 ∶1)抽提勻漿液，4 ℃，7 500 g 離心5 min，取上清;加入1/10 體積的65 ℃的CTAB/NaCl 抽提液，顛倒混勻;再用等體積的氯仿/異戊醇(24 ∶1)抽提，顛倒混勻，4 ℃，7 500 g 離心5 min，取上清;加入1/10 體積的CTAB 沉淀液，顛倒混勻，4 ℃，500 g 離心5 min;移除上清，用高鹽TE 緩沖液重懸沉淀;加入0.6 倍體積的異丙醇，充分混勻，于4 ℃，7 500 g 離心15 min;用70%乙醇洗滌沉淀，常溫干燥，溶解于TE 緩沖液中。0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V 的條件下電泳1 h，在凝膠成像儀上觀察DNA 分子的大小、完整性及電泳條帶的清晰度并拍照。

1.6 PCR 擴增PKS5 蛋白激酶基因方法

模板DNA 1 μl，10 ×PCR Buffer 5 μl，MgCl24 μl，dNTP 4 μl，上游引物、下游引物各2 μl，Taq 酶1 μl，加滅菌去離子水至總體積50 μl。擴增程序為:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行35 個循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。反應結束后0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳，80 V，電泳1 h，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶大小、完整性及電泳條帶的清晰度并拍照。隨后回收PCR 產物。

1.7 提取pGEX-6P-1 質粒DNA 的方法(堿裂解法)

取1.5 ml pGEX-6P-1/BL21 轉化子培養(yǎng)物加入2 ml 離心管中，室溫8 000 r/min 離心2 min，棄上清;將細菌沉淀重懸于200 μl 預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，室溫靜置5 min;加400 μl 新鮮配制備的溶液Ⅱ，溫和顛倒混勻2 ～5 次，冰浴5 min;加入300 μl 預冷的溶液Ⅲ，溫和顛倒混勻，冰浴5 min;4 ℃下8 000 r/min 離心5 min，將上清液移至新的離心管中;加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)，振蕩混勻，12 000 r/min 離心5 min。取上層水相移至一新離心管中，加入0.6 倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置5 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，棄上清;沉淀用70%乙醇漂洗1 次，4 ℃12 000 r/min 離心5 min。棄上清，室溫干燥，沉淀溶于適量50 μL 滅菌去離子水(pH 8.0)中。用0.8% 的瓊脂糖凝膠電泳，80 V，電泳1 h，在凝膠成像儀上觀察質粒DNA 的大小、完整性及電泳條帶的清晰度并拍照。

1.8 限制性核酸內切酶消化及重組質粒制備方法

將PCR 產物和pGEX-6P-1 質粒DNA 用BamHI 和EcoRI 雙酶切，待反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測、拍照。電泳條帶合適后，將PCR 產物6 μl，pGEX-6P-1 酶切質粒2μl，T4 DNA ligase buffer 1 μl，T4 DNA 連接酶1μl 充分混合，16 ℃下保溫過夜，－4 ℃保存供后續(xù)實驗使用。

1.9 感受態(tài)細胞制備方法(CaCl2 法)

參照大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化的方法［8］，本實驗室加以改進，從LB 平板上挑取新活化的大腸桿菌BL21 單菌落，接種于5 ml 的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩過夜;取100 μl 培養(yǎng)液，轉接于5 ml 的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)使A600達到0.5～0.6 左右;將培養(yǎng)液3 ml 移至Eppendorf 管中、冰浴20 min;4 ℃條件下，3 000 r/min 離心5 min，棄上清;將沉淀輕緩的懸于1 ml 冰冷的MgCl2(pH7.2)溶液中，按上步方法離心，棄上清;再將沉淀輕緩的懸于0.5 ml冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(pH7.2)溶液中;冰浴20 ～30 min 后，4℃條件下，3 000 r/min離心5 min，棄上清;細胞沉淀用100 μl 冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(pH 7.2)懸浮。冰浴放置，備用。

1.10 感受態(tài)細胞的轉化

將重組質粒pGEX-6P-1/PKS5 DNA 加入100μl 感受態(tài)細胞中，吸打混勻;冰上放置30 min;將試管放入42℃水浴鍋中熱擊1 min;將上述溶液移入盛有1 ml預熱的(37 ℃)SOC 培養(yǎng)液的Eppendorf 管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h;取50 μl 涂布于含Amp 的LB 平板上;37℃培養(yǎng)16 ～24 h，觀察結果。

1.11 IPTG 誘導pGEX 重組子表達

按照Chaperone Competent Cell BL21 Series(Cat.#9120 ～9125 v0902)說明書介紹的方法，將含有pGEX-6p-1 重組子的BL21 菌落接種于2 ml 含Amp(100 μg/ ml)和氯霉素(2 μg/ ml)的LB 培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，至A600達0.5(0.4 ～0.6)左右;加入四環(huán)素至終濃度10 ng/ml。繼續(xù)培養(yǎng)至A600為0.6 時，15℃振蕩培養(yǎng)30 min;取出1 ml 樣品作為IPTG 誘導前的樣品，－20 ℃保存;其余樣品中加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，15℃振蕩培養(yǎng)3 ～5 h;分別在l、2、3、4 h后取出1.0 ml 樣品作為IPTG 誘導后的樣品，－20 ℃保存;將IPTG 誘導前樣品與誘導后的樣品5 000 r/min離心5 min。分別回收菌體沉淀;沉淀樣品中分別加入100 μl 2 ×樣品緩沖液和100 μl 無菌水，在漩渦混合器上劇烈振蕩，使菌體完全分散，將樣品在沸水浴中保持10 min，立即放入冰浴中冷卻;12 000 r/min離心2 min，回收上清液至一新的離心管中;取10 μl誘導前的對照樣品與5 μl 誘導后的樣品以及5 μl Protein MW Marker 上樣，進行SDS-PAGE 分析［9］。

2 結果與分析

2.1 擬南芥基因組DNA 的提取結果

按照1.6 的制備方法，提取擬南芥基因組DNA，在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測:取樣品10 μl，加2 μl 6 ×Loading Buffer，80 V 電泳1 h，電泳結束后，與凝膠成像系統(tǒng)成像，提取結果如圖1 所示，擬南芥基因組DNA 大小在21 kb 左右。

2.2 PCR 擴增結果

以擬南芥基因組DNA 為模板進行擴增，電泳結果如圖2 所示。大約在1.3 kb 處有一特異擴增條帶，應該是PKS5 基因(PKS5 基因的實際大小為1 345 bp)，此外在100 ～200 bp 左右處有大量的非特異性擴增產物。

2.3 pGEX-6P-1 質粒DNA 的提取結果

以堿裂解法提取的pGEX-6p-1 質粒經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后如圖3 所示。pGEX-6p-1 質粒大小在4.9 kb 左右，可以作為載體進行后續(xù)操作。

圖1 擬南芥基因組DNA

圖2 擬南芥基因組PCR 產物

圖3 pGEX-6P-1 質粒DNA

2.4 限制性核酸內切酶消化結果

用BamHI 和EcoRI 雙酶切PKS5 基因擴增產物及pGEX-6p-1 質粒。在37 ℃條件下反應2 h，然后用0.8%凝膠電泳，其結果如圖4 所示。PKS5 基因擴增產物酶切后在1. 3 kb 處，pGEX-6p-1 質粒酶切后在4.9 kb 處。

2.5 SDS-PAGE 電泳結果

將pGEX-6p-1 質粒、PCR 擴增產物分別進行EcoRI 和BamHI 雙酶切后，用T4 DNA 連接酶連接。將連接好的重組質粒轉入E.coli BL21 中，經藍白篩選挑選陽性克隆轉化子在含Amp、氯霉素、Tet 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng);在培養(yǎng)中途加入誘導物IPTG 誘導細胞大量表達PKS5 蛋白激酶，然后進行SDS-PAGE 分析，結果如圖5 所示。①為誘導1 h 樣品的條帶;②為誘導2 h 樣品的條帶;③為誘導3 h 樣品的條帶;④為誘導5 h樣品的條帶。IPTG 誘導時間越長，GST-PKS5 融合蛋白表達量越高。

圖4 pGEX-6P-1 質粒DNA 酶切及PCR 產物酶切

圖5 PKS5 蛋白激酶在E.coli 中的表達

3 結 語

本實驗的試驗規(guī)模較大，學生在實驗過程中會同時進行實驗設計和實驗操作兩部分的內容，這樣就避免了按照傳統(tǒng)教學模式中“照方抓藥”［12］的情況的出現。

這個實驗，不僅使學生學到了基本的實驗操作技能，還培養(yǎng)他們提出問題，分析問題與解決問題的能力，讓他們學會去舉一反三，全方位多角度的去考慮問題。同時也使學生形成一個基本的科研思路，培養(yǎng)了他們獨立思考的能力［13］。

同時，由于實驗的整體性，在整個的實驗過程中，一個環(huán)節(jié)的失誤就會導致整個實驗的失敗，所以學生在實驗的過程中定會更加認真和謹慎地進行實驗操作，這樣的實驗教學設計有助于學生養(yǎng)成良好的實驗習慣，形成嚴謹認真的科學態(tài)度。

另外，本實驗僅涉及到PKS5蛋白激酶克隆與表達的部分內容，而對于本實驗，還有很多可以擴展的內容，如:PKS5 蛋白激酶表達活性的測定［14］，蛋白質雙向電泳western bolt［15］，擬南芥轉基因植株的耐鹽性分析［16］等。所以，本實驗還有很大的拓展空間。學生可以根據自身的認知情況和學習興趣，繼續(xù)設計后續(xù)實驗方案，并在此過程中逐步培養(yǎng)其探索精神。

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