劉麗萍 ，王 艷

(黑龍江大學(xué)a.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心;b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室;c.農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150080)

0 引 言

為了探明無融合生殖甜菜單體附加系M14 品系高頻傳遞的原因和機理，本文在壓片法及子房透明技術(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用去壁低滲法制備無融合生殖甜菜單體附加系M14 的染色體標(biāo)本，提高了對附加的1 條白花甜菜染色體的識別效率。

去壁、低滲法是陳瑞陽對中國果樹及野生近緣植物染色體標(biāo)本的研究改良技術(shù)，對栽培植物的遺傳育種以及對世界栽培植物的起源與演化都起著重要的理論和指導(dǎo)意義。植物染色體研究在三、四十年代起過先驅(qū)作用，但50 年代后與動物染色體研究相比發(fā)展緩慢［1］。近年來，由于染色體技術(shù)的不斷發(fā)明和完善，使涉及以染色體為基礎(chǔ)細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、染色體工程學(xué)等領(lǐng)域都取得了長足的進展［2-5］。

無融合生殖是指不經(jīng)過雌雄配子融合而產(chǎn)生種子的一種特殊生殖方式，能使基因型的雜合性得以保持，從而固定雜種優(yōu)勢，對作物育種具有重要的意義［6-9］。我院無融合生殖甜菜研究于1988 年開始進行栽培甜菜與野生白花甜菜的種間雜交工作。以栽培甜菜為母本，白花甜菜為父本進行雜交，獲得真實雜種VC88-1(VVCC、2n=4χ=36)。利用栽培甜菜回交產(chǎn)生帶有白花甜菜的單體附加系，獲得了栽培甜菜附加一條白花甜菜第9 號染色體的M14 單體附加系系列［10-12］，從而將攜帶無融合生殖基因的一條白花甜菜染色體轉(zhuǎn)移到栽培甜菜。使原來只進行有性生殖的栽培甜菜可以高效表達無融合生殖特性［13-14］，并可以通過母本95%以上高頻傳遞后代。經(jīng)形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)鑒定［15］，發(fā)現(xiàn)甜菜單體附加系M14 具有有性生殖與二倍體孢子生殖特性，為兼性無融合生殖體［16］。甜菜課題組每年春天都以鏡檢的方式對染色體傳遞率進行檢查并分析。鏡檢方法一直使用常規(guī)的壓片法［17］，其速度快潔、方法簡便易行，即便如此，壓片法也只是停留在染色體計數(shù)水平。

本實驗應(yīng)用去壁低滲法通過熒光顯微技術(shù)可以快速找到附加的一條白花甜菜第九號染色體，它常常游離于栽培甜菜染色體之外，使本來難以分辨的那條附加的白花甜菜染色體更加易于識別與分離。為無融合生殖甜菜的染色體微分離、微克隆、Fish 熒光原位雜交等提供了前提條件和技術(shù)保障。

1 實驗器材及試劑

1.1 實驗器材

顯微鏡(具有照相設(shè)備);培養(yǎng)箱(室溫至60 ℃);蒸餾水重蒸設(shè)備;冰箱(0 ℃);超凈臺;載玻片;眼科鑷子;保安刀片;磨口三角瓶(50 ～100 mL);移液管(10～20 mL);移液器;燒杯(50、100 mL);試劑瓶(125、250、500 mL);刻度滴管(1、2 mL);酒精燈;普通玻璃板20 cm×20 cm;牙簽;5 mL 青霉素瓶。

1.2 試 劑

Giemsa 母液配制。0.5 g Giemsa 粉加33 mL 優(yōu)質(zhì)丙三醇于研缽中，充分研磨1 h→放入56 ℃溫箱2 h，再加入33 mL 甲醇(GR)混勻裝瓶備用(儲存的時間越長越好)。

Giemsa 染色液。100 mL 磷酸緩沖液加入3 ～5 mL Giemsa 母液(用前現(xiàn)配)。

磷酸緩沖液。A 液［0.067 mol/L 磷酸二氫鉀］:稱磷酸二氫鉀49.118 g 加蒸餾水定溶至1 000 mL;B液［0.067 mol/L 磷酸氫二鈉］:稱磷酸氫二鈉9.467 g加蒸餾水定溶至1 000 mL。

混合酶液。纖維素酶、果膠酶各0. 5 g，加入20 mL 無菌水即為2.5%的混合酶液(冰箱保存，不宜過久)。實驗材料與酶液的體積比控制在1 ∶20 ～1 ∶50。酶解的材料經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次并浸泡30 min，除掉固定液。酶解時間:0.5 ～2.0 h。

前低滲。用滴管吸去處理液，直接換入0. 075 mol/L 氯化鉀溶液致使細胞膨大，然后滴片。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

無融合生殖甜菜M14(2n =18 +1，附加一條白花甜菜第9 號染色體)。取室內(nèi)培養(yǎng)的根尖做試材。

2.2 實驗方法

2.2.1 根尖培養(yǎng)及固定

將甜菜種子用70%乙醇浸泡1 ～2 min→0.001 L汞浸泡10 min→用無菌水洗3 ～4 次→在無菌水中浸泡24 h 后，將種子平鋪于培養(yǎng)皿中，蓋上一層紗布，于25 ℃溫箱中培養(yǎng)。每天早晚更換2 次水。試驗材料可以在實驗室內(nèi)隨時培養(yǎng)。取樣部位根尖分生區(qū)。甜菜根尖小，切取根尖1 ～2 mm 長進行預(yù)處理，用0.2 mmol/L 8-羥基喹啉處理2 ～4 h，蒸餾水洗2 次。經(jīng)前低滲的材料，用甲醇∶冰醋酸(3 ∶1)的卡諾固定液固定，固定時間如果超過4 h，可將材料轉(zhuǎn)入70%酒精中長期保存。

2.2.2 涂片法和滴片法制備染色體標(biāo)本

將預(yù)處理過2 h 的實驗材料進行前低滲(0.075 mol/L KCl 溶液)使細胞膨大，用2.5%混合酶液酶解0.5 ～2 h，去掉細胞壁，再進行后低滲，后低滲液用重蒸水將實驗材料反復(fù)處理2 ～3 次。

涂片:將處理好的材料用3 ∶1 的卡諾固定液固定20 ～30 min 后涂片，火焰干燥后用已經(jīng)配制好的Giemsa 染色液染色，鏡檢觀察。

滴片:將后低滲的材料制備成細胞懸液:先用(3 ∶1)卡諾固定液固定→去沉淀，制成細胞懸液→去上清后再制成細胞懸液，用移液器將細胞打散，距離載玻片約0. 33 m 高度進行垂直滴片，火焰干燥后用Giemsa 染色，鏡檢觀察。

3 實驗結(jié)果與分析

該技術(shù)操作程序簡單、快速、省時，實驗材料的準(zhǔn)備室內(nèi)即可完成。實驗結(jié)果表明染色體分散效果良好，利用Olympus-BX51 型熒光顯微鏡可以清晰地觀察到無融合生殖甜菜分散效果良好的分裂相。實驗材料:根尖的分裂相不如心葉多。

滴片法(見圖1)較凃片法(見圖2)觀察到的視野更加清爽、干凈。從圖1 能觀察到染色體自然裸露的雜合狀態(tài)——附加的一條白花甜菜染色體游離于栽培甜菜18 條染色體之外，更加易于識別分辨與分離。

圖1 溶片法制備染色體標(biāo)本 圖2 涂片法制備染色體標(biāo)本

4 結(jié) 語

實驗過程中必須注意的是:清潔無污染，制片在無菌操作室進行，以便對染色體進行后續(xù)操作。載玻片清洗滅菌消毒后置于載片盒內(nèi)存放于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。先固定后酶解，后低滲時間要充足，甜菜組織經(jīng)過低滲之后，細胞經(jīng)過長時間的浸泡會吸水膨脹使細胞更加充盈飽滿，滴片時要注意高度垂直、有力度，使細胞滴落到載片后染色體達到自然散開的狀態(tài)。另外實驗材料與酶液的體積比要控制在1 ∶20 ～1 ∶50 之間。如需長期保存可用丁香油封片。本實驗?zāi)軌驅(qū)o融合生殖甜菜染色體進行后續(xù)分離及Fish 熒光原位雜交，對無融合生殖甜菜的深入研究具有重要意義。

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