趙召霞呂曉峰盧建華潘世揚(yáng)侯軍良夏文穎戴二黑★

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慢性HBV感染者血漿循環(huán)DNA水平相關(guān)因素的研究

趙召霞1呂曉峰2盧建華1潘世揚(yáng)3侯軍良1夏文穎3戴二黑1★

目的探討影響慢性HBV感染者血漿循環(huán)DNA水平變化的相關(guān)因素。方法選擇145例慢性HBV感染者作為研究對(duì)象，其中慢性乙型肝炎輕度30例、中度30例、重度25例；乙肝后肝硬化30例；肝癌30例。選擇30例健康體檢者作為對(duì)照組。采用雙重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)血漿中循環(huán)DNA的含量。結(jié)果隨著慢性乙型肝炎病情加重，外周循環(huán)DNA水平逐漸升高，但在肝硬化組循環(huán)DNA水平反而降低，肝癌組又顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在115例慢性HBV感染者中HBeAg陽(yáng)性79例，HBeAg陰性36例，HBeAg陽(yáng)性患者外周循環(huán)DNA水平（68.79±14.23 ng/mL）顯著高于HBeAg陰性患者（23.68±12.56 ng/mL）（t=2.162, P=0.032）；慢性HBV感染者外周循環(huán)DNA水平與ALT和AST水平呈顯著正相關(guān)，r值分別為0.612和0.632，P值分別為0.014和0.021，但與血清HBV DNA無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論慢性HBV感染者外周循環(huán)DNA水平與病毒復(fù)制無(wú)關(guān)，但可反映肝細(xì)胞的炎癥壞死程度。

循環(huán)DNA；肝炎；乙型；慢性；聚合酶鏈反應(yīng)

循環(huán)DNA的研究主要有定性和定量研究，前者主要檢測(cè)血清或血漿中各種腫瘤特異性基因的改變，目前的研究甚多；后者檢測(cè)則以血循環(huán)DNA總量為指標(biāo)，是人體健康評(píng)判的重要指標(biāo)，其量的改變與多種疾?。ò[瘤、嚴(yán)重外傷、感染性疾病和器官移植等）關(guān)系密切。慢性HBV感染者最初主要發(fā)生肝臟的炎性反應(yīng)和壞死，隨著疾病發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，在這過(guò)程中其循環(huán)DNA的量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。本研究旨在探討慢性HBV感染者血漿循環(huán)DNA水平變化的相關(guān)因素，為慢性HBV感染者病程中不同階段的診斷和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

145例慢性HBV感染者系2008年10月～2009年12月肝病科住院患者，男97例，女48例。年齡18～56（27±15）歲。其中慢性乙型肝炎輕度30例，中度30例，重度25例，乙肝后肝硬化30例，肝癌30例。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)與感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的“慢性乙型肝炎防治指南”[1]，所有肝癌患者均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者均排除合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎。同時(shí)選擇30例健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中男15例，女15例。年齡17～46（29±11）歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血漿標(biāo)本的采集和保存：晨起采集空腹靜脈血5 mL EDTA抗凝，3000 r/min離心 ，吸取上清于1.5 mL離心管中，再16 000 r/min離心10 min，吸取上層無(wú)細(xì)胞血漿200 μL,置于含有5.0×104拷貝重組質(zhì)粒0.2 mL離心管（江蘇省人民醫(yī)院潘世揚(yáng)教授饋贈(zèng)）中，充分混勻后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿循環(huán)DNA的提取：采用磁珠法對(duì)血漿DNA和重組質(zhì)粒同步提取，試劑盒由上海浩源生物科技有限公司提供。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)血漿循環(huán)DNA：采用雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)提取的血漿DNA，試劑盒由江蘇省人民醫(yī)院潘世揚(yáng)教授饋贈(zèng)。

1.2.4 血清ALT、AST和HBV標(biāo)志物的檢測(cè)：采用雅培C8000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT和AST。采用ELISA法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)，試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供。采用ABI7300核酸擴(kuò)增儀檢測(cè)HBV DNA，試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV感染者外周循環(huán)DNA和轉(zhuǎn)氨酶水平的比較

隨著慢性乙型肝炎病情加重，外周循環(huán)DNA水平逐漸升高，但在肝硬化組循環(huán)DNA水平反而降低，肝癌組又顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)氨酶的變化在病情加重時(shí)逐漸升高，肝硬化時(shí)降低，肝癌組顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

2.2 慢性HBV感染者循環(huán)DNA與血清HBeAg的關(guān)系

在115例慢性HBV感染者中HBeAg陽(yáng)性79例，HBeAg陰性36例，HBeAg陽(yáng)性患者外周循環(huán)DNA水平（68.79±14.23 ng/mL）顯著高于HBeAg陰性患者（23.68±12.56 ng/mL），見(jiàn)表2。

2.3 慢性HBV感染者循環(huán)DNA與血清HBV DNA相關(guān)性分析

慢性HBV感染者HBV DNA與外周循環(huán)DNA無(wú)相關(guān)性（P=0.061）。

表1 慢性HBV感染者外周循環(huán)DNA和轉(zhuǎn)氨酶水平的比較Table 1 Changes of circulating DNA and alanine aminotransferase in patients with chronic HBV infection

表2 慢性HBV感染者循環(huán)DNA與血清HBeAg的關(guān)系Table 2 The relationship between circulating DNA and serumHBeAg in chronic HBV infection patients

2.4 慢性HBV感染者循環(huán)DNA與ALT和AST相關(guān)性分析

慢性HBV感染者循環(huán)DNA水平與ALT和AST呈顯著正相關(guān)，r值分別為0.612和0.632，P值分別為0.014和0.021。

3 討論

循環(huán)DNA是存在于人體液中的游離狀態(tài)的核酸，生理情況下體內(nèi)游離循環(huán)DNA主要由少量衰老死亡細(xì)胞釋放所產(chǎn)生，其生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，維持在較恒定的低水平[2]。病理情況下當(dāng)組織細(xì)胞受到來(lái)自外源的刺激后主動(dòng)分泌或者細(xì)胞損傷、死亡后產(chǎn)生。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)循環(huán)DNA與很多疾病的發(fā)展密切相關(guān)，尤其是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[3]。本文研究結(jié)果顯示隨著慢性乙型肝炎患者病情加重，外周循環(huán)DNA水平逐漸升高，慢性乙型肝炎重度組外周循環(huán)DNA含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明外周循環(huán)DNA可在一定程度上反映肝臟的炎癥壞死程度。當(dāng)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)輕微，壞死的肝細(xì)胞較少時(shí)，釋放至外周循環(huán)DNA也少，隨著病情的加重，肝細(xì)胞炎癥壞死增加，釋放到外周的循環(huán)DNA會(huì)明顯增加，這一結(jié)果也與陳進(jìn)步等[4]人研究結(jié)果一致。肝硬化患者外周循環(huán)DNA較慢性乙型肝炎重度組顯著降低，可能由于肝硬化時(shí)大量的肝細(xì)胞已經(jīng)被破壞，肝組織被大量纖維組織取代，產(chǎn)生和釋放的循環(huán)DNA量減少。肝癌患者循環(huán)DNA水平顯著高于慢性乙肝患者，這一結(jié)果與屠紅等[5]研究結(jié)果一致，肝癌患者外周循環(huán)DNA除了來(lái)源于腫瘤組織壞死釋放游離DNA進(jìn)入血液循環(huán)外，更主要的是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞分泌和釋放的核酸。

研究結(jié)果顯示慢性HBV感染者HBeAg陽(yáng)性組外周循環(huán)DNA水平顯著高于HBeAg陰性組，其原因可能是HBeAg不僅是HBV復(fù)制的指標(biāo)之一，同時(shí)HBeAg也是一種免疫調(diào)節(jié)因子[6]。血清中大量的HBeAg能刺激不同的細(xì)胞亞群，使機(jī)體針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，免疫應(yīng)答增強(qiáng)的結(jié)果之一是肝細(xì)胞的變性壞死增多，釋放至外周的循環(huán)DNA也相應(yīng)增加。但是，慢性HBV感染者外周循環(huán)DNA與HBV DNA水平無(wú)相關(guān)性，血清中HBV DNA在一定程度上代表的是病毒血癥，即反映病毒復(fù)制的水平，通常HBV并不直接導(dǎo)致肝臟的細(xì)胞病變[7]，因而循環(huán)DNA與病毒的復(fù)制水平無(wú)直接的相關(guān)性。

臨床上觀察肝功能的敏感指標(biāo)是血清ALT和AST，當(dāng)肝細(xì)胞被破壞，細(xì)胞膜通透性增大時(shí)ALT升高，當(dāng)線粒體損傷時(shí)AST增高，ALT和AST升高都提示肝細(xì)胞受破壞。本研究結(jié)果顯示外周循環(huán)DNA與ALT、AST呈正相關(guān)，而且隨著慢性乙型肝炎患者病情加重，外周循環(huán)DNA水平逐漸升高。因此，循環(huán)DNA的變化亦能反映肝細(xì)胞壞死損傷的嚴(yán)重程度。

本研究結(jié)果提示外周循環(huán)DNA的含量與HBV復(fù)制無(wú)相關(guān)性，但在一定程度上能反映肝細(xì)胞的炎癥壞死程度，即隨著慢性乙型肝炎由輕度向重度進(jìn)展，循環(huán)DNA水平也在逐漸升高。但是，隨著病情遷延不愈，在肝硬化時(shí)循環(huán)DNA水平有一個(gè)降低的拐點(diǎn)，而發(fā)生肝癌時(shí)循環(huán)DNA水平再次顯著升高，且升高幅度非常大，顯著高于慢性乙肝患者，包括慢乙肝重度患者。因此，有必要深入研究循環(huán)DNA是否可作為肝癌的標(biāo)志物之一。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中華傳染病雜志, 2005, 23(6): 421-431.

[2]潘世揚(yáng), 王俊宏. 循環(huán)DNA的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn), 2004, 15(3): 1-2.

[3]孫群, 王德先. 游離DNA與臨床腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2010, 16(9): 1348-1350.

[4]陳進(jìn)步, 潘世揚(yáng), 周鎮(zhèn)先, 等. 血漿DNA定量用于重癥肝炎患者肝細(xì)胞損傷評(píng)估[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2009, 27(2): 112-114.

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Study on the related factors of circulating DNA level in patients with chronic HBV infection

ZHAO Zhaoxia1, LV Xiaofeng2, LU Jianhua1, PAN Shiyang3, HOU Junliang1, XIA Wenying3, DAI Erhei1★
(1.Department of Laboratory, the Fifth Hospital of Shijiazhuang, Hebei, Shijiazhuang 050021, China; 2.Department of Hepatology, the People Hospital of Xingtai, Hebei, Xingtai 054031, China; 3.Department of Laboratory, the People Hospital of Jiangsu, Jiangsu, Nanjin 210029, China)

ObjectiveTo explore the related factors of circulating DNA level in patients with chronic HBV infection. Methods One hundred and forty-five patients with chronic HBV infection were enrolled in the study, including 30 cases with mild chronic hepatitis B, 30 cases with moderate chronic hepatitis B, 25 cases with severe chronic hepatitis B, 30 cases with HBV-induced liver cirrhosis, 30 cases with hepatocarcinoma. Thirty healthy persons were also enrolled as control. The level of plasma circular DNA was detected by duplex real-time polymerase chain reaction assay. Results As the condition of patients with chronic hepatitis B exacerbated, the level of circulating DNA increased gradually，but it reduced in patients with HBV-induced liver cirrhosis, then increased significantly in patients with hepatocarcinoma. There were significant differences among groups(P＜0.05). The level of circulating DNA in plasma HBeAg positive group(68.79±14.23 ng/mL) was significantly higher than that of HBeAg negative group(23.68±12.56 ng/mL)(t=2.162, P=0.032).There was a significantly positive relationship between circulating DNA and alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase (r=0.612; 0.632，P=0.014; 0.021). There was no relationship between circulating DNA and HBV DNA in serum(P＞ 0.05). Conclusion The level of circulating DNA in patients with chronic HBV infection had no relationship with viral replication, but reflects the degree of hepatocyte inflammatory necrosis.

Circulating DNA; Hepatitis, Type B, Chronic; Polymerase chain reaction

河北省衛(wèi)生廳指令性課題（No.8189）；江蘇省實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重大課題（No.XK200731）

1.石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北，石家莊 050021 2.邢臺(tái)市人民醫(yī)院肝病科，河北，邢臺(tái) 054031 3.江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇，南京 210029

★通訊作者：戴二黑，E-mail:daieh2008@yahoo.com.cn