張滿娥 黃文蓉 張洪彬

?論 著?

1456例女性HPV基因分型結(jié)果的回顧分析

張滿娥 黃文蓉 張洪彬

目的了解龍巖地區(qū)婦女HPV感染的陽(yáng)性率與各年齡段的關(guān)系及各亞型的分布情況，為該地區(qū)宮頸癌防治及流行病學(xué)研究提供依據(jù)。方法采用反向斑點(diǎn)雜交-基因芯片法檢測(cè)1456例女性宮頸脫落細(xì)胞，以進(jìn)行23種HPV基因型檢測(cè)，計(jì)算HPV感染的陽(yáng)性率和年齡段的關(guān)系及HPV亞型感染分布特點(diǎn)。結(jié)果1456例標(biāo)本中陽(yáng)性540例，陽(yáng)性率為37.09%，檢測(cè)出21種HPV亞型，HPV44亞型和MM4亞型未被檢出。低危亞型組主要以43亞型為主，高危亞型組優(yōu)勢(shì)型別依次為HPV16、58和52。HPV感染的高峰年齡為30～50歲，各年齡組的HPV陽(yáng)性檢出率有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論HPV基因分型檢測(cè)對(duì)宮頸癌防治有較好的指導(dǎo)意義。

人乳頭瘤病毒；基因分型；宮頸癌

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種強(qiáng)嗜上皮性、嚴(yán)格宿主范圍與組織特異性的DNA病毒。HPV可以通過多種途經(jīng)感染生殖道而導(dǎo)致尖銳濕疣及宮頸病變，甚至引起宮頸癌的發(fā)生。HPV感染是宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）和宮頸癌發(fā)生的必要條件，HPV檢測(cè)已成為篩檢宮頸癌的有效方式。HPV感染的型別分布隨地理區(qū)域而變化，明確HPV在特定地區(qū)的感染率及型別分布差異能為該地區(qū)宮頸癌防治及流行病學(xué)研究提供依據(jù)及對(duì)HPV疫苗的開發(fā)應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義。為此我們對(duì)龍巖地區(qū)1456例女性HPV基因分型結(jié)果進(jìn)行回顧分析，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源

2011年4月至2012年4月于本院婦科就診的女性患者1456例，年齡在17～84歲，對(duì)所研究病例以年齡段為分組依據(jù)，20歲以下為一組，60歲以上為一組，中間年齡每10年為一個(gè)年齡段，即為一組。所有患者均為初次進(jìn)行HPV檢測(cè)，剔除二次復(fù)查數(shù)據(jù)。

1.1.2 標(biāo)本采集

醫(yī)生以窺陰器暴露子宮頸，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷深入受檢者宮頸口內(nèi)2～3 cm,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈。取出宮頸刷放入裝有保存液的樣品管中，將多余的刷柄折斷，旋緊管蓋，注明編號(hào)和日期。如不能馬上檢測(cè)，應(yīng)將樣本置于4℃存放，并在一周內(nèi)完成檢測(cè)，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.1.3 儀器與試劑

HPV基因分型檢測(cè)試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法）（深圳亞能生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），配有試劑盒Ⅰ與試劑盒Ⅱ，試劑盒Ⅰ主要為PCR反應(yīng)液，試劑盒Ⅱ?yàn)镠PV各基因亞型芯片、POD母液、TMB、30% H2O2以及裂解液等；PCR儀為美國(guó)ABI公司提供的ABI7000實(shí)時(shí)熒光定量分析儀，分子雜交儀為FINEPCR Combi-H12及YN 2009基因芯片閱讀儀。

1.2 方法

1.2.1 HPV DNA的提?。撼浞窒疵搶m頸刷，并在管壁上擠干。把1 mL洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，13000 rpm離心10 min，棄上清液，加入50 μL裂解液充分懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min，13000 rpm離心10 min，保留上清液待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增HPV DNA：取出PCR反應(yīng)管，在管蓋上做好標(biāo)記，低速離心數(shù)秒，分別加入已提取的待測(cè)樣本DNA 5 μL,低速離心數(shù)秒后，按下述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：50℃ 15 min；95℃ 10 min，94℃ 30 s，42℃90 s，72℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)；最后72℃延長(zhǎng)5 min。

1.2.3 雜交、洗膜與顯色均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。每次試驗(yàn)均設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照作為質(zhì)量控制。

2 結(jié)果

2.1 1456例標(biāo)本中HPV DNA檢出情況見表1

2.2 540例HPV陽(yáng)性標(biāo)本中高危亞型組（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66，68、73、83、MM4）、低危亞型組（HPV6、11、42、43、44）及混合感染組檢測(cè)結(jié)果見表2。

2.3 不同年齡組HPV感染率見表3。

2.4 1456例標(biāo)本中高危亞型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4）與低危亞型（HPV6、11、42、43、44）檢出的例數(shù)分布見表4。

表1 1456例標(biāo)本中HPV DNA檢出情況Table 1 The infection data of HPV DNA from 1456 samples

表2 540例HPV陽(yáng)性標(biāo)本中高危亞型組與低危亞型組檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of high-risk HPV types and low-risk HPV types in 540 cases of HPV positive samples

表3 各年齡組的HPV陽(yáng)性率情況Table 3 The positive rate of HPV in every phase of age

表4 HPV亞型檢出例數(shù)的分布情況Table 4 Distribution of the detected HPV subtypes

3 討論

3.1 HPV基因分型檢測(cè)的意義有：①明確受檢者所感染的HPV病毒類型（高危型，低危型或復(fù)合型），了解患者是持續(xù)感染或新的感染；②根據(jù)感染的HPV亞型預(yù)測(cè)受檢者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，以制定正確合理且有效的治療方案和決定隨訪時(shí)間；③與病理檢查結(jié)果相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)低度病變中的宮頸癌患者；④用于治療后的效果監(jiān)測(cè)；⑤積累本地區(qū)人群HPV感染具體亞型的分布以及與年齡的關(guān)系，為研制適合中國(guó)人群的HPV預(yù)防和治療性疫苗提供數(shù)據(jù)。

3.2 人乳頭瘤病毒感染已被公認(rèn)為是引起宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變的主要原因，HPV檢測(cè)在宮頸癌篩查中的作用已無(wú)可非議[1]。目前已發(fā)現(xiàn)100余種HPV亞型，有35種與生殖道疾病有關(guān)，但大多數(shù)感染是一過性的，可被自身的免疫系統(tǒng)清除，僅有一小部分高危型（HR-HPV）持續(xù)感染可發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）進(jìn)而發(fā)展為浸潤(rùn)癌。子宮頸的癌前病變（CIN）到癌是一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的過程，即宮頸感染HPV→CIN→原位癌→早期浸潤(rùn)癌→浸潤(rùn)癌，研究顯示要經(jīng)歷10年左右時(shí)間[2]。HPV感染可能的致病機(jī)制：在機(jī)體免疫力低下時(shí)整合到機(jī)體的核染色體基因組上，導(dǎo)致p53基因失活，因而不能正常表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)失控[3]。因此，我們可以及早發(fā)現(xiàn)和控制感染潛伏期和中間環(huán)節(jié)，及時(shí)檢測(cè)以篩查高?；颊?，并給予感染者防治性指導(dǎo)，這樣便可大大降低宮頸癌的發(fā)生。

3.3 預(yù)防和治療HPV感染的理想方法是疫苗接種。研制HPV疫苗需要了解各地區(qū)HPV型別的感染狀況及流行趨勢(shì)等資料和該地區(qū)HPV的感染率、感染優(yōu)勢(shì)型別。本研究對(duì)龍巖地區(qū)女性進(jìn)行HPV基因分型，陽(yáng)性檢出率為37.09%，低于遼寧地區(qū)的47.28%[4]，接近重慶永川地區(qū)的37.65%[5]，高于濟(jì)寧等其它地區(qū)的檢出率23～31%[6～10]，這表明HPV的感染存在明顯的地區(qū)差異，應(yīng)針對(duì)本地區(qū)的HPV的感染分布狀況,制定相應(yīng)的預(yù)防措施。

3.4 在中國(guó)大陸HPV感染主要以HPV16亞型為主，居第一位，18亞型居第二位，58和52亞型分別居第三和第四位[11]。調(diào)查顯示龍巖地區(qū)女性HPV感染型別分布情況為低危亞型組主要以43亞型為主，高危亞型組優(yōu)勢(shì)型別依次為HPV16、58和52，這與其它地區(qū)型別分布存在差異[4～10]。這一地域分布特點(diǎn)提示龍巖地區(qū)伴有HPV16、58和52宮頸感染的婦女發(fā)展成宮頸癌的可能性增加，同時(shí)也提示龍巖地區(qū)用于宮頸癌有效預(yù)防的HPV疫苗需要針對(duì)HPV16、58和52等型別。對(duì)于HPV52、58的感染率是否在國(guó)內(nèi)其它地區(qū)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過HPV18，這還有待其它地區(qū)相應(yīng)的研究證實(shí)。

3.5 本調(diào)查結(jié)果顯示各年齡段的陽(yáng)性檢出率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有顯著性差異的，這提示HPV的陽(yáng)性檢出率與年齡有關(guān)。表3中可見＜20歲年齡組陽(yáng)性檢出率較高，但樣本數(shù)較少，同時(shí)為陽(yáng)性百分比最低組；＞60歲年齡組陽(yáng)性檢出率最高，其次分別為20～30歲組和50～60歲組。 HPV感染的高峰年齡為30～50歲，而福州地區(qū)HPV感染的高峰年齡為＜20歲和40～50歲[8]，內(nèi)蒙古自治區(qū)中西部地區(qū)HPV感染的高峰年齡為36～40歲[10]。本研究表明，30～50歲組占陽(yáng)性標(biāo)本中的陽(yáng)性百分比高，因此應(yīng)加強(qiáng)30～50歲婦女HPV的普查力度。

3.6 本調(diào)查顯示龍巖地區(qū)女性HPV感染的單一型別感染率為24.86%,多重感染率為12.23%，高于內(nèi)蒙古地區(qū)的多重感染率6.2%[10]；HPV高危亞型組占陽(yáng)性標(biāo)本的57.04%，HPV低危亞型組占陽(yáng)性標(biāo)本的25.00%，混合感染組占陽(yáng)性標(biāo)本的17.96%，低于濟(jì)寧地區(qū)的復(fù)合型感染率25.3%。有報(bào)道指HPV的多重感染對(duì)宮頸病變的發(fā)展有促進(jìn)作用[6]，這有待于進(jìn)一步探討。

4 結(jié)語(yǔ)

本調(diào)查通過對(duì)患者進(jìn)行HPV檢測(cè)，調(diào)查所獲得的本地區(qū)HPV感染的感染率、感染優(yōu)勢(shì)型別以及高發(fā)年齡段等資料可為本地區(qū)宮頸癌防治提供可靠的數(shù)據(jù)，為干預(yù)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展制定相關(guān)措施提供理論依據(jù)，降低宮頸癌的發(fā)病率，減少社會(huì)醫(yī)療開支。

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Retrospective analysis of 1456 cases of female HPV genotyping results

ZHANG Mane , HUANG Wenrong , ZHANG Hongbin
(Molecular Biology Laboratory, The Second Hospital of Longyan , Fujian Longyan 364000 , China)

Objective To investigate the relationship between the positive rate of female HPV infection and all ages and the distrubution of each subtype in Longyan region, in order to provide the basis for the prevention and control of cervical cancer and epidemiological study. Methods To detect 23 kinds of HPV genotype , calculate the relation between the positive rate of female HPV infection and all ages,the distribution characteristics of each subtype by dot blot hybridization reverse-gene chip to detect 1456 cases of female cervical exfoliated cells. Results 540 in 1456 cases were positive,with 37.09% positive rate. Among 540 positive samples, 21 subtypes of 23 known subtypes were detected .The HPV44 and MM4 subtypes had not been detected in this study.Low-risk type was mainly HPV 43 subtype and high-risk superior types were HPV 16,58 and 52. The peak age of HPV infection ranged from 30 to 50 years old.There was significant difference between different aged groups in HPV positive detection rate(P＜ 0.05). Conclusion HPV genotyping detection is meaningful in cervical cancer prevention and control.

Human papilloma virus; Gene subtypes; Cervical cancer

福建省龍巖市第二醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，福建，龍巖 364000