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2型神經(jīng)纖維瘤病標(biāo)本庫的建立及應(yīng)用分析

趙賦1張晶1王振民2渠沛然2楊智君2王博2劉丕楠1,2★

目的初步建立2型神經(jīng)纖維瘤病（NF2）患者的標(biāo)本庫，分析其臨床應(yīng)用及遺傳學(xué)研究的價值。方法收集NF2患者病例資料并進(jìn)行長期跟蹤隨訪，繪制家族系譜圖并建立信息資料庫；采集NF2患者及家族高危成員外周靜脈血，分離血漿、血清及淋巴細(xì)胞分別保存；術(shù)中獲取新鮮腫瘤組織15 min內(nèi)存入液氮中，部分組織制作成石蠟標(biāo)本；提取腫瘤及淋巴細(xì)胞標(biāo)本中的DNA，質(zhì)檢并保存，采用PCR-DNA測序方法進(jìn)行NF2基因突變分析。結(jié)果已將293例患者信息納入資料庫，并完成定期隨訪；收集腫瘤冰凍標(biāo)本72例，腫瘤石蠟標(biāo)本275例，血液樣本80例；外周血及冰凍腫瘤組織提取DNA的OD260/280值在1.80～1.86之間，198例石蠟樣本提取的DNA片段長度主要分布在1700～2500 bp之間，能滿足分子遺傳學(xué)研究的需要。結(jié)論NF2標(biāo)本庫的建立可為癥狀前基因篩查、遺傳規(guī)律分析及發(fā)病機(jī)制研究提供標(biāo)本來源。

2型神經(jīng)纖維瘤?。粯?biāo)本庫；分子遺傳學(xué)

2型神經(jīng)纖維瘤病（neurofibromatosis 2，NF2）是一種常染色體顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為以中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤為主的全身多發(fā)腫瘤綜合征，臨床治療困難[1]。隨著我院臨床就診患者數(shù)量的不斷增加，迫切需要建立完善的標(biāo)本庫，為NF2早期篩查、臨床治療及發(fā)病機(jī)制的研究提供資料和標(biāo)本。因此，本文將探討如何建立NF2標(biāo)本庫，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2000年1月至2008年4月間，北京天壇醫(yī)院和北京市神經(jīng)外科研究所治療的NF2患者病例資料和腫瘤石蠟標(biāo)本；自2008年5月至今，采集北京天壇醫(yī)院診治NF2患者的臨床資料、腫瘤和血液樣本，以及家庭高危成員的信息資料和血液樣本。

1.2 主要設(shè)備和試劑

液氮儲存罐（Cryosystem 4000，美國MVE）；-80℃低溫冰箱（MDF-U4186S，日本三洋）；高速臺式冷凍型離心機(jī)（Primo R，德國Heraeus）；L500低速自動平衡離心機(jī)（北京京立離心機(jī)儀器有限公司）；紫外分光光度儀（Pharmacia Biotech Uhrospec 3000）；安捷倫2100生物分析儀（Agilent 2100 DNA 7500，美國安捷倫科技有限公司）；紅細(xì)胞裂解液購自北京塞馳生物科技有限公司；Promega公司的基因組DNA 純化試劑盒（Wizard?Genomic DNA Purification Kit）和石蠟樣本基因組DNA小提系統(tǒng)（ReliaPrep? FFPE gDNAMiniprep System）。

1.3 標(biāo)本取材和保存方法

1.3.1 血液標(biāo)本的采集、處理及保存

采血前征得患者同意，簽署標(biāo)本采集知情同意書。真空采血管采集10 mL外周靜脈血，其中6 mL為EDTA抗凝，4 mL不抗凝。非抗凝血室溫靜置 后，3000 r/min離心5 min，吸取上層血清分裝入離心管中?？鼓懿裳箢嵉够靹?次，室溫靜置30 min后，3000 r/min離心5 min，吸取上層血漿分裝入離心管中；下層細(xì)胞沉淀移至15 mL離心管內(nèi)，加入10～12 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育10 min，1000 r/min離心10 min，棄上層紅色清液。用生理鹽水輕輕吹打沖洗所留取沉淀物3次，1000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復(fù)2～3遍，收集白色沉淀即為淋巴細(xì)胞。全部操作均在無菌條件下進(jìn)行，血清和血漿保存于-80℃冰箱內(nèi)，淋巴細(xì)胞保存于液氮內(nèi)。

1.3.2 新鮮腫瘤標(biāo)本的采集與保存

手術(shù)過程中獲取新鮮腫瘤組織，在無菌條件下取無燒灼、無壞死的腫瘤組織，用生理鹽水將血液沖洗干凈后，取1/3腫瘤組織修剪成直徑為0.5 cm小塊3～5份，放入帶標(biāo)簽的凍存管中，新鮮組織需在離體后15 min內(nèi)放入液氮內(nèi)。其余2/3放入3.8%多聚甲醛固定液用于病理檢查。

1.3.3 石蠟標(biāo)本的采集

標(biāo)本經(jīng)固定后常規(guī)取材、脫水、包埋，制作成石蠟標(biāo)本，對其進(jìn)行切片、HE及免疫組化染色，確定腫瘤組織性質(zhì)。詳細(xì)記錄病理學(xué)結(jié)果，取剩余樣本制作成石蠟標(biāo)本保存于標(biāo)本庫中。

1.3.4 DNA的純化與保存

取部分裂解后淋巴細(xì)胞，用渦旋振蕩器劇烈混勻直至重懸；冰凍腫瘤組織用研缽研槌研磨，待液氮揮發(fā)后取10～20 mg腫瘤組織，采用Promega公司W(wǎng)izard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒淋巴細(xì)胞及冰凍組織提取基因組DNA說明提取上述基因組DNA。取10～20 mg石蠟組織切片，采用FFPE gDNA小提系統(tǒng)常規(guī)脫蠟后提取組織DNA。取1μL樣本用分光光度計進(jìn)行DNA純度鑒定，并用Aglient2100生物分析儀檢測DNA的完整性，所有提取DNA均保存在-20℃冰箱中。

1.4 資料信息化管理

將患者病歷資料、隨訪記錄、遺傳學(xué)信息及標(biāo)本存放等四部分內(nèi)容進(jìn)行信息化管理。①自行設(shè)計和開發(fā)一套資料管理操作系統(tǒng)應(yīng)用于病歷資料管理，病歷資料包括：基本信息表、病史特點(diǎn)、影像學(xué)特點(diǎn)以及家族史等內(nèi)容；②隨訪記錄包括：患者病情進(jìn)展、長期治療經(jīng)過、復(fù)查癥狀和體征變化等信息，同時建立家庭高危成員長期隨訪記錄表，以便在其癥狀出現(xiàn)前進(jìn)行臨床干預(yù)；③遺傳學(xué)信息包括：患者NF2基因突變類型和位點(diǎn)，相關(guān)家庭高危成員進(jìn)行基因檢測的篩查結(jié)果，并繪制家族系譜圖；④標(biāo)本按家系分別存放，存放信息包括：患者入庫編號、入庫時間、標(biāo)本類型及數(shù)量、存放位置等。

1.5 分析方法

采用Primer 6.0設(shè)計引物并用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物DNA經(jīng)回收純化，用DNA分析儀進(jìn)行雙向測序，對22q12上NF2基因序列進(jìn)行測序分析。

2 結(jié)果

已收集和整理386例NF2病例資料，其中門診或電話跟蹤隨訪293例，建立隨訪記錄并納入患者信息庫。信息庫中包括男性156例，女性137例，患者發(fā)病年齡在7～71歲之間，平均為30.5歲；家族遺傳性患者76例，相關(guān)家庭高危成員103例，其中10歲以下兒童42例，上述患者均繪制家族系譜圖（圖1）。

圖1 一例三代家族遺傳性NF2患者的家族系譜圖Figure 1 Family tree of inherited patients of NF2

目前，已保存各類腫瘤石蠟標(biāo)本275例、冰凍標(biāo)本72例，患者外周血液標(biāo)本80例，制定合理的標(biāo)本采集流程規(guī)范，初步建立起包含血清、血漿及淋巴細(xì)胞標(biāo)本、冰凍及石蠟?zāi)[瘤標(biāo)本和DNA標(biāo)本的NF2腫瘤標(biāo)本庫。從血液、冰凍組織樣本中提取DNA并進(jìn)行質(zhì)檢，OD260/280比值分別為1.85和1.80～1.86之間；198例石蠟樣本DNA片段長度主要分布在1700～2500 bp之間（圖2）。

對標(biāo)本庫保存的樣本進(jìn)行NF2基因的測序，包括27例石蠟標(biāo)本、15例冰凍標(biāo)本和12例血液樣本，在外顯子序列中共發(fā)現(xiàn)出51個位點(diǎn)發(fā)生突變，5例散發(fā)患者存在體細(xì)胞鑲嵌現(xiàn)象（圖3）；對14例家庭高危成員血液標(biāo)本進(jìn)行篩查，6例發(fā)現(xiàn)遺傳位點(diǎn)存在基因突變（圖4）。結(jié)果顯示：標(biāo)本庫采集并存放的各類樣本，可進(jìn)一步用于NF2相關(guān)的分子遺傳學(xué)研究。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，使得人們對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展能有更深入的認(rèn)識。而建立完善的標(biāo)本庫能更規(guī)范和高效地利用腫瘤標(biāo)本，從而進(jìn)行多個領(lǐng)域的研究。對于NF2這類少見的遺傳性疾病來說，進(jìn)行基因水平的研究，不僅可揭示腫瘤的形成機(jī)制和相關(guān)功能基因特征，而且可用以指導(dǎo)疾病早期診斷及靶向治療。目前已明確NF2是由常染色體22q12上的NF2抑癌基因突變引起的，其編碼的Merlin蛋白功能異常或缺乏時將引起腫瘤生長。但NF2基因突變的規(guī)律及Merlin蛋白的功能尚未得以完全闡明[2]，且疾病相關(guān)研究的進(jìn)展緩慢。原因可能是由于NF2發(fā)病率低且分布散在，未能形成大規(guī)模的病例資料統(tǒng)計和完善的腫瘤標(biāo)本庫造成的。目前，全世界僅英國曼徹斯特的圣瑪麗醫(yī)院建立了較大規(guī)模的NF2標(biāo)本庫，并據(jù)此開展了一系列研究[3]。由于NF2突變可能因種族或地域的不同存在一定的差異性，因此，建立我國NF2患者的標(biāo)本庫，將為研究NF2發(fā)生機(jī)理和遺傳規(guī)律起到重要作用。此外，在散發(fā)的聽神經(jīng)瘤、腦膜瘤和室管膜瘤中也發(fā)現(xiàn)存在NF2基因突變[4]，采集腫瘤標(biāo)本也將有助于進(jìn)一步揭示NF2基因在腦腫瘤中的作用機(jī)制。

圖2 石蠟標(biāo)本DNA質(zhì)檢結(jié)果Figure 2 DNA quality control results of FFPE samples

圖3 一例散發(fā)NF2患者測序圖Figure 3 Sequencing results of a sporadic patient of NF2

圖4 一例家系遺傳NF2患者的DNA測序圖Figure 4 Sequencing results of a inherited patient of NF2

由于NF2為常染色體顯性遺傳病，患者約有50%的概率將突變傳給下一代。隨著診斷及治療水平的不斷提高，我國將有越來越多的患者得到及時地治療，患者年齡也將更加年輕化。但NF2發(fā)病方式多樣化，目前確診標(biāo)準(zhǔn)仍以臨床表現(xiàn)為依據(jù)，不能進(jìn)行有效地早期干預(yù)。因此，開展基因?qū)W分析特別是針對家族性病例，能更有效地開展治療和指導(dǎo)性服務(wù)，包括治療方案的確立、早期家庭的臨床護(hù)理、計劃生育咨詢和產(chǎn)前診斷等。當(dāng)受累患者確定存在某個突變時，應(yīng)采集家庭高危成員的血液標(biāo)本，提取DNA并進(jìn)行NF2基因突變檢測?？刹捎没驕y序技術(shù)聯(lián)合多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），對NF2基因所有外顯子進(jìn)行基因序列分析，其檢測的敏感度達(dá)91～95%[5]。由于新發(fā)的NF2患者可能存在體細(xì)胞鑲嵌現(xiàn)象，可將血液及腫瘤樣本共同檢測，才能更好的確定突變。對于兒童進(jìn)行癥狀前檢測的最佳時機(jī)仍存在爭議[6]，但盡早確診能讓患者及家庭成員做好各方面準(zhǔn)備，從而進(jìn)行疾病的監(jiān)測和治療。家族遺傳的病例應(yīng)詳細(xì)繪制家族系譜圖，并以家系為單位存放資料和各個標(biāo)本，為NF2遺傳規(guī)律的研究和長期家庭治療打下基礎(chǔ)。

要建立一個符合國際標(biāo)準(zhǔn)的NF2腫瘤標(biāo)本庫，規(guī)范化的標(biāo)本采集、保存及使用是必要的，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理和登記。由于NF2患者都需要接受多次治療，應(yīng)詳細(xì)記錄治療經(jīng)過并建立完善的信息資料庫，為后續(xù)治療提供指導(dǎo)和幫助。如果患者選擇在當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行手術(shù)治療，通常不能獲取高質(zhì)量的凍存組織標(biāo)本，石蠟標(biāo)本同樣可以作為較好的研究對象。石蠟樣本提取DNA的質(zhì)量能夠較好地滿足PCR反應(yīng)和基因測序要求，有研究顯示[7]石蠟樣本可用于開展芯片技術(shù)和RNA的分析。標(biāo)本的良好運(yùn)用也將為臨床治療提供更多新的思路，Plotkin報道了[8]根據(jù)NF2聽神經(jīng)鞘瘤石蠟樣本免疫組化結(jié)果，嘗試用貝伐單抗進(jìn)行藥物治療，有效地減小了聽神經(jīng)瘤體積。因此，在建立NF2完善的腫瘤標(biāo)本庫基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)行合理地開發(fā)和利用，有望盡早發(fā)現(xiàn)在基因水平上阻斷NF2腫瘤發(fā)生的新方法。

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Establishment and analysis of neurofibromatosis type 2 bank for research

ZHAO Fu1, ZHANG Jing1, WANG Zhenmin2, QU Peiran2, YANG Zhijun2, WANG Bo2, LIU Pinan1,2★
(1. Beijing Neurosurgical Institute, Affiliated of Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China; 2. Department of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital, Affiliated of Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective To establish tissue bank of neurofibromatosis type 2 (NF2) and analysis its scientific value. Methods Medical records and long-term follow-up data of NF2 patients were collected for the establishment of data bank. Blood specimens of patients and high-risk family members of NF2 were taken, and the plasma, serum and lymphocytes were saved separately. Fresh tissues of NF2 tumors were obtained during the surgery and stored in liquid nitrogen, and some parts of tissue were formalin-fixed and parrffinembedded(FFPE). DNA of tumors and lymphocytes were extracted. Multipiex PCR and DNA seguencing were used for gene mutations analysis and screening test. Results 293 cases of NF2 patients, 72 specimens of frozen tissue, 275 specimens of FFPE tissue and 80 samples of blood were collected. OD260/280 ratios of DNA were between 1.80～1.86, and DNA fragments of 198 FFPE samples are between 1700～2500 bp. Both of them could be used for molecular genetic research. Conclusion Establishment of NF2 tissue bank could supply materials and datas for pre-symptomatic genetic screening, analysis of inheritance law and research of pathogenesis.

Neurofibromatosis type 2; Bank; Molecular genetics

國家科技支撐計劃課題（2012BAI12B03）；北京市自然科學(xué)基金（7112049）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才隊伍建設(shè)專項經(jīng)費(fèi)資助

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京市神經(jīng)外科研究所，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050

★通訊作者：劉丕楠，E-mail:liupinan@gmail.com