羅凱王倩潘東曉盧敏瑩賀智敏★

?論 著?

一種KRAS基因突變檢測方法的建立及初步應(yīng)用

羅凱1王倩2潘東曉1盧敏瑩1賀智敏1★

目的建立一種KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測方法，并初步探討其臨床應(yīng)用價值。方法以KRAS基因熱點突變區(qū)域12、13密碼子為研究位點設(shè)計特異性擴增、測序引物，利用已知野生型、突變型樣品以TA克隆技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒作為標準品，建立KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測方法，并進行方法學(xué)和應(yīng)用評估。結(jié)果成功構(gòu)建了KRAS基因12、13密碼子野生型、突變型質(zhì)粒。建立了KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測方法，該方法靈敏度高（9.39×101copies/uL），重復(fù)性好（實時熒光定量PCR部分批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.60%、2.54%）。該法與傳統(tǒng)Sanger測序法同時檢測40例臨床樣品，結(jié)果符合率為100%。結(jié)論本研究成功建立了可用于臨床樣品檢測的KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測方法。

KRAS；突變；基因測序；實時熒光定量PCR

KRAS基因為RAS基因家族中的一員，屬細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白類原癌基因，位于人類染色體12 p，含4個編碼外顯子和1個5'端非編碼外顯子，共同編碼含189個氨基酸、分子量為21 kD的RAS蛋白。RAS蛋白是一種膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，可作為分子開關(guān)，參與細胞外生長、增殖、分化等信號向胞內(nèi)傳遞的過程。當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時可致RAS蛋白異?；罨?，刺激細胞持續(xù)生長或分化，最終導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。在許多腫瘤中KRAS基因的突變率較高，如結(jié)直腸癌和非小細胞肺癌中突變率分別可達30～60%[1]和21～28%[2,3,4]。同時在上述兩種腫瘤中約80～90%的KRAS基因突變發(fā)生在突變熱點2號外顯子12、13密碼子上[5,6]。

目前，NSCLC的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）靶向治療和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的表皮生長因子受體單抗靶向治療已在臨床應(yīng)用。相關(guān)研究表明[7]，存在KRAS基因突變的NSCLC和結(jié)直腸癌患者分別對TKI和表皮生長因子受體單抗靶向治療無反應(yīng)性。因此檢測KRAS基因突變對于指導(dǎo)NSCLC和結(jié)直腸癌患者的靶向治療具有重要意義。

測序法是基因突變檢測的“金標準”方法，傳統(tǒng)Sanger測序法具有結(jié)果準確、重復(fù)性好、可檢測已知與未知突變的優(yōu)點，但同時也存在步驟多、耗時長、易污染、靈敏度低等缺點。因此建立一種步驟更簡、性能更優(yōu)的突變測序檢測方法十分必要。而實時熒光定量PCR是目前普遍應(yīng)用的一種快速、靈敏、污染少的基因擴增檢測方法[8]。本研究以KRAS基因12、13密碼子為靶點，將應(yīng)用熒光染料（EvaGreen）的實時熒光定量PCR法與Sanger測序法相結(jié)合，擬建立KRAS基因突變實時熒光定量PCR-Sanger測序檢測方法，并初步探討其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集2011年9月至2012年8月年廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院NSCLC患者腫瘤組織樣品20例，其中石蠟切片樣品18例，新鮮組織樣品2例；男性12例，女性8例；年齡38～89歲，中位年齡55歲。另收集同時期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織樣品20例，其中石蠟切片樣品2例，新鮮組織樣品18例；男性10例，女性10例；年齡47～77歲，中位年齡60歲。

1.2 試劑和儀器

DNA提取試劑盒為北京天根的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒；Taq酶為大連寶生物的Taq HS酶；熒光染料為美國Biotium的EvaGreen；測序試劑為美國ABI的BigDye3.1試劑盒；實時熒光PCR儀為美國ABI的7500Fast；測序儀為美國ABI的3130xl。

1.3 實驗引物

依據(jù)GENE BANK中KRAS基因的參考序列（NG_007524.1），利用Primer 5.0設(shè)計KRAS基因12、13密碼子擴增引物，并將下游引物作為測序引物，由上海Invitrogen公司合成。序列如下：上游引物5'CCT GCT GAA AAT GAC 3'，下游引物5'CAA AGA ATG GTC CTG 3'，目的片段長169 bp。

1.4 標準品制備

用設(shè)計的PCR引物擴增1例已經(jīng)測序鑒定為KRAS基因12密碼子G12A（GGT＞GCT）突變的結(jié)直腸癌組織樣品，然后利用美國Thermo的膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物克隆于大連寶生物的PMD-19質(zhì)粒，挑菌測序鑒定克隆成功與否并分離野生型與突變型質(zhì)粒分別作為野生型標準品和突變型標準品。增菌培養(yǎng)后美國Thermo質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，美國Thermo NANODR 2000超微量分光光度計測定質(zhì)粒核酸濃度，計算標準品拷貝數(shù)。

1.5 性能評價實驗

將野生型標準品按10倍倍比稀釋為9.39×107copies/uL至9.39×101copies/uL梯度，每個梯度隔天實時熒光定量PCR重復(fù)測定3次，每次各梯度做3個復(fù)管，3次批間實時熒光定量PCR實驗中各隨機抽取1組標準品梯度的PCR產(chǎn)物完成后續(xù)的Sanger測序?qū)嶒?，以此評估方法的靈敏度、批間和批內(nèi)重復(fù)性。

1.6 樣品DNA提取

石蠟切片樣品：取石蠟切片6～15片（腫瘤組織含量越高、面積越大，檢測用切片數(shù)越少），每片滴加1～2滴二甲苯，潔凈手術(shù)刀片刮取玻片上組織放入含1 mL二甲苯的1.5 mL離心管中，靜置10 min，離心去上清。1 mL二甲苯重復(fù)樣品脫蠟1次，1 mL無水乙醇洗滌樣品2次。室溫開蓋靜置待酒精徹底揮發(fā)干凈。

新鮮組織樣品：潔凈手術(shù)刀對待檢樣品做4～6點取樣放入1.5 mL離心管中，75%酒精洗滌樣品一次，棄上清。室溫開蓋靜置待酒精徹底揮發(fā)干凈。

樣品DNA提?。喊丛噭┖姓f明書提取樣品DNA，超微量分光光度計測定樣品DNA含量與純度。

1.7 實時熒光定量PCR反應(yīng)及產(chǎn)物純化

反應(yīng)體系：TaKaRa TaqHS（5 U/uL）0.125 uL、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 uL、dNTP Mixture（各2.5 mM）2 uL、EvaGreen 1 uL、上游引物（5 pM/uL）2 uL、下游引物（5 pM/uL）2 uL、ddH2O 13.375 uL、樣品DNA 2 uL。

反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃45 s（采集熒光），45個循環(huán)；融解曲線。

產(chǎn)物純化：取PCR產(chǎn)物5 uL加入2 uL 北京鑫諾SAP酶混合物混勻，37℃ 1 h，80℃ 15 min。

1.8 PCR產(chǎn)物測序

測序反應(yīng)體系：純化PCR產(chǎn)物1～3 uL、Bigdye3.1 1 uL、下游引物（5 pM/uL）2 uL，補水至總體積6 uL。反應(yīng)條件：96℃ 1 min；96℃ 10 s、50℃ 5 s、60℃ 4 min，25個循環(huán)；4℃恒溫。測序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)醋酸鈉乙醇純化后上機測序。

1.9 測序結(jié)果分析

所得序列圖采用Chromas2.23軟件通過與NCBI基因庫KRAS基因標準序列比對，分析測序結(jié)果。

1.10 與傳統(tǒng)Sanger測序法的比對實驗

將上述40例樣品同時使用北京鑫諾KRAS基因突變測序檢測試劑盒平行檢測，實驗按試劑盒說明書操作，對比分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測法的建立

以經(jīng)測序鑒定為KRAS基因12密碼子G12A（GGT＞GCT）突變的結(jié)直腸癌組織樣品DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，可見陽性擴增曲線和單一的融解曲線峰（解鏈溫度：80.06）；將PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，可見169 bp的單一電泳條帶；進行PCR產(chǎn)物測序并分析結(jié)果，所測序列與擬檢測KRAS目標序列完全相符，同時可見G12A（GGT＞GCT）突變型測序峰圖。以上結(jié)果表明本研究所采用的引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件是合適的，KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測法已初步建立（圖1）。

2.2 標準品的鑒定

構(gòu)建的野生型重組質(zhì)粒標準品經(jīng)測序鑒定插入的169 bp片段與KRAS基因參考序列（NG_007524.1）完全一致，換算濃度為9.39×1010copies/uL。構(gòu)建的突變型重組質(zhì)粒標準品經(jīng)測序鑒定插入的169 bp片段為KRAS基因G12A（GGT＞GCT）突變片段，換算濃度為8.7×1010copies/uL，將原液稀釋為8.7×105copies/uL應(yīng)用液作為后續(xù)實驗的陽性對照。

2.3 檢測范圍與靈敏度分析

將野生型標準品按10倍倍比稀釋為9.39×109～9.39 ×101copies/uL濃度梯度，取各稀釋度做實時熒光定量PCR反應(yīng)，見圖2。由圖可見本實時熒光定量PCR體系標準曲線的R2=0.985，而去掉9.3×101copies/uL濃度梯度重新分析，則標準曲線的R2=0.993，可見本熒光定量PCR體系在9.39×109～9.39×102copies/uL范圍內(nèi)線性較好，但檢測下限可達9.39×101copies/uL。各野生型標準品梯度PCR產(chǎn)物均成功完成后續(xù)測序檢測。以上結(jié)果顯示本KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測方法的靈敏度可達9.39×101copies/uL。

圖1 KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR-Sanger測序突變檢測結(jié)果Figure 1 The detection results of KRAS gene mutaection by Sanger sequencing combined with Real-time PCR

2.4 重復(fù)性分析

對線性范圍內(nèi)9.39×109～9.39×102copies/uL野生型標準品梯度做實時熒光定量PCR體系批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗，實驗結(jié)束后設(shè)置相同閾值線分析結(jié)果，獲得各反應(yīng)曲線的CT值進行重復(fù)性分析。結(jié)果為：各梯度批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.64%、1.69%、1.60%、1.37%、0.62%、1.82%、1.69%、1.78%，平均變異系數(shù)為1.60%；各梯度批間變異系數(shù)分別為2.20%、2.36%、3.09%、2.13%、1.97%、2.74%、3.23%、2.62%，平均變異系數(shù)為2.54%。3次批間熒光定量PCR實驗中各隨機抽取1組標準品梯度的PCR產(chǎn)物均成功完成后續(xù)測序檢測。結(jié)果表明該法具有良好的重復(fù)性。

2.5 比對實驗結(jié)果

實時熒光定量PCR-Sanger測序法與常規(guī)Sanger測序法檢測NSCLC、結(jié)直腸癌樣品共40例，結(jié)果完全相符。其中NSCLC患者和結(jié)直腸癌患者KRAS基因12、13密碼子突變率分別為5%和45%，詳見表1。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素調(diào)控、多階段進展的過程，有多種基因參與腫瘤細胞的生長、增殖、分化與凋亡。其中KRAS基因編碼的RAS蛋白是細胞外信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)的信號通路網(wǎng)絡(luò)中的主要蛋白之一，其可作為分子開關(guān)參與細胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控，KRAS基因突變會導(dǎo)致RAS蛋白的異?；罨?，從而持續(xù)激活RAS-Raf-MEK-ERK等信號通路，導(dǎo)致細胞異常增生，促進腫瘤形成[9,10]。故KRAS基因是近年來腫瘤靶向治療領(lǐng)域的熱門研究靶點之一，其突變也會影響相關(guān)靶向藥物的療效。NCCN腫瘤學(xué)臨床實踐指南中國版（2009）指出NSCLC患者KRAS基因突變與TKI治療耐藥有關(guān)，檢測KRAS基因突變有助于應(yīng)用TKI治療患者的選擇；轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者也應(yīng)檢測KRAS基因狀態(tài)，KRAS基因突變型患者提示EGFR單抗靶向治療無效。因此，準確、有效的檢測KRAS基因突變已成為臨床的常規(guī)需求之一。

目前，基因突變的檢測方法主要包括Taqman實時熒光PCR法、探針擴增阻滯突變系統(tǒng)、蝎型探針擴增阻滯突變系統(tǒng)、高分辨率溶解曲線分析法、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法和測序法等多種方法，其中測序法為金標準方法，并已應(yīng)用于臨床基因突變檢測。測序法檢測基因突變具有重復(fù)性好、準確度高、可檢測已知與未知突變、可明確具體突變類型等優(yōu)點，但同時也存在步驟多、耗時長、易污染、靈敏度低等缺點[11]。

圖2 A：各濃度梯度標準品實時熒光定量PCR擴增曲線圖。B：定量標準曲線

表1 臨床樣品KRAS基因12、13密碼子突變檢測結(jié)果Table 1 Clinical samples KRAS gene codon12 and codon13 mutation test results

傳統(tǒng)的Sanger測序法利用定性PCR結(jié)合瓊脂糖電泳模式對目的片段進行擴增與擴增效果鑒定，然后再對擴增產(chǎn)物進行序列測定。該模式存在一些弊端影響臨床應(yīng)用，主要包括：1、步驟繁瑣，耗時長。2、電泳時易產(chǎn)生大量PCR產(chǎn)物氣溶膠造成污染引起假陽性。3、電泳檢測的靈敏度較低，低濃度樣品易漏檢。4、無法對樣品模板濃度定量，導(dǎo)致高拷貝樣品在測序反應(yīng)時因加入過多的PCR產(chǎn)物而出現(xiàn)異常測序峰圖影響突變結(jié)果的判讀。本研究建立的KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCR擴增體系通過分析樣品熒光反應(yīng)曲線即可判斷擴增是否成功，同時可利用融解曲線監(jiān)測反應(yīng)的特異性，相較傳統(tǒng)定性PCR結(jié)合瓊脂糖電泳模式來說，不僅步驟簡化、時間縮短，還避免了電泳時可能產(chǎn)生的大量產(chǎn)物氣溶膠所造成的污染。同時，結(jié)合熒光染料的實時熒光定量PCR無需設(shè)計合成特殊探針而僅需加入熒光染料即可實現(xiàn)對樣品的實時、定量檢測，故成本低廉且可有效指導(dǎo)后續(xù)測序反應(yīng)步驟產(chǎn)物加樣量而得到理想的測序峰圖。王征等[12]報道，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳鑒定的檢出下限僅達103copies/uL，本研究建立的實時熒光定量PCR的檢測下限達9.39×101copies/uL高于電泳鑒定，且檢測下限反應(yīng)管的PCR產(chǎn)物量同時滿足后續(xù)測序步驟的實驗要求，故本研究建立的實時熒光定量PCRSanger測序法的檢測下限可達9.39×101copies/uL，較傳統(tǒng)Sanger測序法能更好地檢出低濃度樣品。

相關(guān)研究報道[13,14,15]中國人中NSCLC、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的KRAS基因突變率分別約為8～13%和30%。本研究使用實時熒光定量PCR-Sanger測序法檢測NSCLC、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌各20例樣品的KRAS基因突變，突變率分別為5%和45%，與相關(guān)報道基本相符。本研究還利用基于傳統(tǒng)Sanger測序法的KRAS基因突變商品化檢測試劑盒平行檢測同批樣品，兩法結(jié)果完全相符。表明本研究建立的實時熒光定量PCR-Sanger測序法可用于臨床樣品的KRAS基因突變檢測。

本研究所建立的KRAS基因?qū)崟r熒光定量PCRSanger測序突變檢測方法相對傳統(tǒng)Sanger測序法具有步驟簡化、時間縮短、污染減少、靈敏度提高和可定量檢測樣品濃度等優(yōu)點，具有較好的臨床應(yīng)用價值，可為指導(dǎo)相關(guān)腫瘤的靶向治療工作提供有效的技術(shù)支持。

[1]Wicki A, Herrmann R, Christofori G. Kras in metastatic colorectal cancer[J]. Swiss Med Wkly, 2010, 140: w13112.

[2]Cortot A B, Italiano A, Burel-Vandenbos F, et a1. KRAS mutation status in primary nonsmall cell lung cancer and matched metastases[J]. Cancer, 2010, 116(11): 2682-2687.

[3]Kriegsh?user G, Fabjani G, Ziegler B, et a1. Biochip-based detection of KRAS mutation in non-small cell lung cancer[J]. Int J Mol Sci, 2011, 12(12): 8530-8538.

[4]Pennycuick A, Simpson T, Crawley D, et a1. Routine EGFR and KRAS Mutation analysis using COLD-PCR in non-small cell lung cancer[J]. Int J Clin Pract, 2012, 66(8): 748-752.

[5]劉麗琴, 張海燕, 王捷. KRAS基因突變檢測與結(jié)直腸癌分子靶向治療的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2011, 19(4): 802-804.

[6]Roberts P J, Stinchcombe T E, Der C J, et a1. Personalized medicine in non-small-cell lung cancer: is KRAS a useful marker in selecting patients for epidermal growth factor receptor-targeted therapy[J]. J Clin Oncol, 2010, 28(31): 4769-4777.

[7]Linardou H, Dahabreh I J, Kanaloupiti D, et a1. Assessment of somatic k-RAS mutations as a mechanism associated with resistance to EGFR-targeted agents: a systematic review and meta-analysis of studies in advanced non-small-cell lung cancer and metastatic colorectal cancer[J]. Lancet Oncol, 2008, 9(10): 962-972.

[8]王梁燕, 洪奇華, 張耀洲. 實時定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 細胞生物學(xué)雜志, 2004, 26(1): 62-67.

[9]Margaret P, Quinlan, Jeffrey Settleman. 癌癥啟動中Kras的特異性功能[J]. 癌癥, 2008, 27(7): 673-674.

[10]Thomas P, Jennifer L. KRAS mutation testing in colorectal cancer[J]. Adv Anat Pathol, 2009, 16(4): 196-203.

[11]高云, 陳嘉昌, 朱振宇, 等. EGFR基因突變及其檢測方法的研究進展[J]. 分子診斷與治療雜志, 2011, 3(1): 51-57.

[12]王征, 郭巍, 姬媛媛, 等. 馬皰疹病毒1型SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2012, 34(2): 116-119.

[13]于忠和, 周卉. KRAS基因在非小細胞肺癌患者外周血和腫瘤組織中的突變研究[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2011, 5(13): 3919-3923.

[14]Xu J, He J, Yang H, et a1. Somatic mutation analysis of EGFR, KRAS, BRAF and PIK3CA in 861 patients with non-small cell lung cancer[J]. Cancer Biomark, 2011, 10(2): 63-69.

[15]韓文生, 娜琴, 陳阿梅. 結(jié)腸癌K-ras基因研究進展[J]. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2011, 19(4): 10-12.

Establishment of a method about detecting KRAS gene mutations and its application

LUO Kai1, WANG Qian2, PAN Dongxiao1, LU Minying1, HE Zhimin1★
(1.Guangzhou Medical University Cancer Institute and Hospital, Guangdong, Guangzhou 510095, China; 2. Pathology Department, Guangzhou Hospital of TCM, Guangdong, Guangzhou 510130, China)

Objective To establish a method about detecting KRAS gene mutations through Sanger sequencing combined with Real-time PCR and evaluate its clinical value. Methods A KRAS gene mutations detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR was established with specific primers targeting the hotspot mutation region (codon12 and codon13), and wild-type plasmid and mutant plasmid were constructed as the standard samples. Then the performance and application of method were assessed. Results

The standard plasmids were constructed successfully. A KRAS gene mutations detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR was established successfully which owned high sensitivity (9.39×101copies/uL) and good repeatability(intra-assay CV and inter-assay CV of the Real-time PCR were 1.60% and 2.54%, respectively). There was no difference between traditional Sanger sequencing and Sanger sequencing combined with Real-time PCR to detect KRAS gene mutations in 40 clinical samples. Conclusion The established mutation detection method through Sanger sequencing combined with Real-time PCR can be used in clinical samples to detect KRAS gene mutations.

KRAS; Mutation; Gene sequencing; Real-time PCR

1.廣州醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東，廣州，510095 2.廣州市中醫(yī)院病理科，廣東，廣州，510130