李 彬，張西正，朱 旭，高 皓

成骨細(xì)胞是骨組織修復(fù)過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，其增殖活性和功能狀態(tài)的改變直接反映了骨組織生長(zhǎng)重建的狀態(tài)。大量研究證實(shí)，應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和位置發(fā)生改變，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響蛋白質(zhì)的活性、基因的表達(dá)，最終調(diào)控骨的生成與重建［1－4］。然而，這些已有的研究結(jié)果還是難以解釋其中復(fù)雜的生理學(xué)現(xiàn)象。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為研究應(yīng)力、應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的改變提供了新的方法。通過(guò)差異蛋白質(zhì)組研究可以篩選并識(shí)別參與細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的重要蛋白質(zhì)，為深入探索其機(jī)制提供信息［5］。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)比較成骨細(xì)胞在應(yīng)力作用下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，找出在應(yīng)變作用下，發(fā)生了明顯、穩(wěn)定的質(zhì)和量改變的差異蛋白，為骨缺損、骨折不愈合的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar 乳鼠(48 ～72 h)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所二級(jí)動(dòng)物房提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó));胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司);丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸(glycine)(Bio－Rad公司，美國(guó));四甲基乙二胺(TEMED)、Triton X－100、3－［3－(膽酰胺基丙基)二甲基銨基］－1－丙磺酸鹽(CHAPS)、Pharmalyte 3－10(Sigma 公司，美國(guó));IPG 緩沖液、IPG 干膠條(pH =3－10;L =7cm)尿素(Urea)、低分子量標(biāo)記物(Amersham Pharmacia 公司，美國(guó));二硫蘇糖醇(DTT)(Promega公司，美國(guó));十二烷基磺酸鈉(SDS)(Nacalai tesque公司，日本);苯甲基磺酰氟(PMSF)(Merck 公司，德國(guó));三羥甲基氨基甲烷(Tris)(華美生物工程公司，中國(guó));碘乙酞胺(iodoacetamide)(Fluka 公司，美國(guó))。其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要設(shè)備 Mini－PROTEAN 電泳單元及附件、ProteinⅡ垂直電泳單元及附件(Bio－Rad 公司，美國(guó));IPGphor、附件和循環(huán)水浴(Amersham Pharmacia公司，美國(guó));3 K18 高速低溫離心機(jī)(Sigma 公司，美國(guó));U－2001 紫外分光光度計(jì)(HITACHI 公司，日本);NAPCO CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific 公司，美國(guó));CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific 公司3111 型，美國(guó));超凈工作臺(tái)(蘇凈公司SW－CJ－1F 型，中國(guó));倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本);體外牽張應(yīng)力加載細(xì)胞培養(yǎng)體系為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所張西正教授研制的四點(diǎn)彎曲細(xì)胞單向交變應(yīng)變細(xì)胞加載裝置。圖像分析軟件為Image Master.2D Elite(Version 2.00)(Amersham Pharmacia 公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)、純化、鑒定及加載處理 采用消化傳代法及細(xì)胞反復(fù)貼壁法對(duì)Wistar 大鼠乳鼠顱蓋骨進(jìn)行成骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及純化，獲得的細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，以10%DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)第三代細(xì)胞進(jìn)行鈣－鈷法ALP 染色，Ⅰ型膠原免疫組化染色，HE染色法鑒定細(xì)胞形態(tài)，以確認(rèn)其為成骨細(xì)胞。取生長(zhǎng)良好的第三代成骨細(xì)胞，以5×104密度接種于四點(diǎn)彎曲加載裝置中，可彎曲的彈性長(zhǎng)方形培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)小室上，待細(xì)胞大部貼壁后，根據(jù)文獻(xiàn)［6］選擇以下參數(shù):以頻率為0.5 Hz，應(yīng)變水平2000 με 條件下加載6 h，設(shè)等量對(duì)照，對(duì)照組在整個(gè)培養(yǎng)期間不加力。

1.2.2 雙向凝膠電泳 將加載6 h 后的細(xì)胞培養(yǎng)板取下，0.25%胰酶消化，裂解細(xì)胞后將產(chǎn)物于4 ℃下，14 000 r/min 離心30 min。取上清液采用考馬亮藍(lán)G250 法對(duì)蛋白溶液進(jìn)行定量。將蛋白樣品溶液與適量泡脹緩沖液(8.0 MUrea，2%CHAPS，2.8%DTT，0.5%IPG Buffer，痕量溴酚藍(lán))混勻，總體積為125 μl，其中上樣量為200 μg，取IPG 膠條轉(zhuǎn)移入第一向等電聚焦電泳槽。等電聚焦結(jié)束后，取出IPG膠條置于含DTT 的平衡緩沖液中平衡，將平衡好的膠條放入預(yù)先制備好的SDS－PAGE 凝膠中進(jìn)行第二向垂直電泳。在14 ～15 ℃時(shí)，以每一膠條30 mA恒流電泳，直至溴酚藍(lán)前沿至玻璃板下緣為止。凝膠行考馬亮藍(lán)R250 染色。1.2.3 圖像掃描與分析 染色后的雙向電泳凝膠用GS－710 光密度儀透射掃描。利用圖像配比分析找出表達(dá)差異蛋白斑點(diǎn)，然后根據(jù)光密度值的變化來(lái)判斷蛋白斑點(diǎn)表達(dá)量的變化，利用設(shè)置定量和統(tǒng)計(jì)參數(shù)來(lái)分析兩者之間的差別。為了較準(zhǔn)確地反映蛋白點(diǎn)量的變化，將每個(gè)點(diǎn)的含量表示為體積百分含量，即一個(gè)蛋白點(diǎn)的量占該膠內(nèi)所有蛋白點(diǎn)總量的百分?jǐn)?shù)，也稱相對(duì)含量。蛋白點(diǎn)分子量和等電點(diǎn)采用二維校正法確定。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均在Microsoft Excel 2000 中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)提取率 采用考馬亮藍(lán)G250 對(duì)蛋白進(jìn)行定量，用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.9989。每4 塊培養(yǎng)板可收集細(xì)胞4 ×106左右，每實(shí)驗(yàn)批次收集細(xì)胞106個(gè)，加入裂解液60 μl，平均蛋白濃度為(5.58 ±0.30)μg/μl。

2.2 對(duì)照組和加載組成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)組譜圖 對(duì)照組和加載組成骨細(xì)胞從培養(yǎng)到雙向電泳各重復(fù)4 次，圖1 為分辨率和重復(fù)性較好的2－DE 圖譜。對(duì)照組平均檢測(cè)到(512 ±11)個(gè)蛋白點(diǎn)，加載組平均檢測(cè)到(533 ±14)個(gè)蛋白點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量分布范圍廣，但大多數(shù)集中于pI(等電點(diǎn))4 ～7、分子量20 ～100 ku 區(qū)域。匹配結(jié)果顯示，對(duì)照組成骨細(xì)胞中平均匹配的蛋白點(diǎn)為413 個(gè)，加載組為411，平均匹配百分率分別是80.6%和77.2%，對(duì)照組成骨細(xì)胞的匹配率高于加載組，這與把它選做參考膠有關(guān)。

2.3 應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化9 種蛋白的表達(dá)在應(yīng)變作用后發(fā)生了明顯的改變。其中2 種在應(yīng)變作用后表達(dá)降低，7 種增高。差異蛋白的部分放大圖譜如圖2、3。等電點(diǎn)、分子量見(jiàn)表1。

圖2 應(yīng)變作用后部分差異蛋白的放大圖譜(加載組表達(dá)增加的組)

圖3 應(yīng)變作用后差異蛋白的放大圖譜(加載組表達(dá)減少的組)

表1 應(yīng)變作用后9 種蛋白質(zhì)變化情況

3 討論

有關(guān)應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)2－DE 的樣品制備方法目前鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)蛋白質(zhì)樣品制備應(yīng)該遵循的幾個(gè)基本原則［7，8］，對(duì)應(yīng)力作用下鼠成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)2－DE 樣品制備的各個(gè)環(huán)節(jié)和參數(shù)進(jìn)行了一定的優(yōu)化，初步建立了行之有效的成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)2－DE 樣品的制備方法。首先，選擇了含CHAPS 而非TritonX－100 的裂解液作為工作液，是因?yàn)楫?dāng)單獨(dú)使用尿素的時(shí)候，CHAPS 的效果比TritonX－100 要好［9］。其次，筆者在提取細(xì)胞后，用PBS 清洗后馬上加入裂解液，充分裂解后及時(shí)上樣，使樣本制備步驟盡可能簡(jiǎn)單，避免了反復(fù)凍融樣本及復(fù)雜樣本制備步驟會(huì)損失樣本中的部分蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)［10］。再者，采用了考馬亮藍(lán)R250 染色，上樣量選擇為200 μg。一方面是因?yàn)殂y染法存在某些不足，如一些條帶的可重復(fù)性差，動(dòng)力學(xué)范圍小，一些普通的蛋白染色較差甚至根本沒(méi)有，并且對(duì)以后的質(zhì)譜測(cè)定也有干擾，必須先脫銀等;另一方面，如上樣量過(guò)高，則高豐度蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)過(guò)大會(huì)影響其他蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離和分析。

蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可能以多種mRNA形式剪接，并且同一蛋白質(zhì)可能以多種形式進(jìn)行翻譯后的修飾。一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目可以超過(guò)基因組的數(shù)目，因此蛋白質(zhì)表達(dá)譜比mRNA 表達(dá)譜更能真實(shí)地反映生物體的功能及其機(jī)制。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)比成骨細(xì)胞加載前后蛋白電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，兩組電泳的蛋白點(diǎn)大多數(shù)集中于pI(等電點(diǎn))4 ～7、分子量20 ～100 ku 的區(qū)域，其中至少有9 種蛋白質(zhì)在應(yīng)變作用后發(fā)生了明顯和穩(wěn)定的質(zhì)和量的改變。已有文獻(xiàn)［11、12］運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析了在應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞基因表達(dá)的差異，表明應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞多種基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，這些變化基因的生物學(xué)功能涉及成骨、細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架重建等諸多方面。而本試驗(yàn)中所獲得的9 種差異表達(dá)蛋白質(zhì)也應(yīng)該牽涉其中，甚至可能是成骨細(xì)胞在應(yīng)變作用下，基因表達(dá)發(fā)生變化后合成的新蛋白質(zhì)。

臨床各種原因所致骨缺損、骨不連的修復(fù)重建是一個(gè)重要課題，組織工程技術(shù)為這一課題帶來(lái)新的亮點(diǎn)和希望。已有運(yùn)用同種異體軟骨細(xì)胞或PDILA 復(fù)合物進(jìn)行即時(shí)修復(fù)軟骨缺損的成功試驗(yàn)［13］，表明組織工程化骨有望成為一種理想的骨缺損修復(fù)材料。實(shí)現(xiàn)骨材料中成骨細(xì)胞的大量增殖和分化一直是骨科研究熱點(diǎn)，目前健康人成骨細(xì)胞系的建立多采用健康成人的松質(zhì)骨或4 月齡正常胎兒的四肢皮質(zhì)骨進(jìn)行分離、培養(yǎng)。但由于人體研究的特殊性，人成骨細(xì)胞系的建立不同程度受到取材及倫理的制約，目前不少學(xué)者用新生大鼠的顱骨分離成骨細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的成骨細(xì)胞的形態(tài)特征、生物學(xué)活性及發(fā)生鈣化的功能，是體外實(shí)驗(yàn)研究的理想模型，因此本試驗(yàn)也采用鼠成骨細(xì)胞作為研究對(duì)象。本研究中表達(dá)發(fā)生改變的9 種差異蛋白質(zhì)就可能在應(yīng)力作用下對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化起著重要作用。如能找出可以促進(jìn)成骨及細(xì)胞增殖的特異蛋白或新的蛋白并加以提取，將其與細(xì)胞、支架材料復(fù)合，聯(lián)合在體外進(jìn)行三維培養(yǎng)，應(yīng)該能為體外構(gòu)建組織工程化骨，從而為解決臨床上骨缺損、骨折不愈合的難題提供新的解決方法。

［1］ Batra N N，Li Y J，Yellowley C E，et al. Effects of short－term recovery periods on fluid－induced signaling in osteoblastic cells［J］. J Biomech，2005，38(9):1909－1917.

［2］ Liedert A，Kaspar D，Blakytny R，et al. Signal transduction pathways involved in mechanotransduction in bone cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2006，349(1):1－5.

［3］ Viola V，Michael S. Local force and geometry sensing regulate cell functions［J］. Mol cell biol，2006，7(4):265－275.

［4］ Guo Yong，Zhang Chunqiu，Zeng Qiangcheng，et al.Mechanical strain promotes osteoblast ECM formation and improves its osteoinductive potential［J］.BioMedical Engineering OnLine，2012，11(1):80.

［5］ 李 敏，周 慧，崔銀秋. 蛋白質(zhì)組學(xué)方法在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)通訊，2007，18(2):336－338.

［6］ 張西正，李 彬，郭 勇. 不同應(yīng)變對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性及功能狀態(tài)的影響［J］. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2005，9(2):69－72.

［7］ Gazzana G，Borlak J. Improved method for proteome mapping of the liver by 2－DE MALDI－TOF MS［J］.J Proteome Res，2007，6(8):143－151.

［8］ 應(yīng)天翼.淺析雙向凝膠電泳的樣品制備［J］. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2008，4:61－65.

［9］ Herbert B R，Molloy M P，Gooley A A，et al. Improved solubility in two－dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as reducing agent［J］. E1ectrophoresis，1998，19:845－851.

［10］ Lilley K S，Razzaq A，Dupree P. Two－dimensional gel electrophoresis:recent advances in sample preparation，detection and quantitation［J］. Curr Opin Chem Biol，2002，6(1):46－50.

［11］ 林福春，張兵兵，辛 娟，等.力生長(zhǎng)因子E 肽與應(yīng)力刺激對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響［J］. 醫(yī)用生物力學(xué)，2012，27(1):65－71.

［12］ Li Yongming，Qiu Jun. Effects of mechanical stress on the gene expression profiles of human osteoblasts［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2008，24(6):651－654.

［13］ 李景紅，黃金中，程 友，等. 同種異體軟骨細(xì)胞/聚乳酸復(fù)合物即時(shí)修復(fù)兔耳廓軟骨缺損［J］. 武警醫(yī)學(xué)，2004，15(10):735－738.