姚 琦，張立才，倪 杰，侯 宇，劉長振，郁衛(wèi)東，張里程

骨質(zhì)疏松癥理想的治療方法是促進(jìn)成骨［1］。骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)［2］是SOST 基因的產(chǎn)物，而且由骨細(xì)胞特異性表達(dá)。最新研究表明，骨硬化蛋白單克隆抗體具有增加骨量和骨密度，促進(jìn)正常板層骨結(jié)構(gòu)形成及增加骨強(qiáng)度作用［3－8］。目前，一種人源化的骨硬化蛋白單克隆抗體(AMG785)已經(jīng)開始了臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，并被證實(shí)能有效增加絕經(jīng)后婦女骨密度［9，10］。然而骨硬化蛋白單克隆抗體存在分子質(zhì)量過大、免疫原性強(qiáng)等缺點(diǎn)。單鏈抗體(single chain Fv，scFv)是在單克隆抗體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型抗體，具有分子量小、滲透性高、抗原結(jié)合活性高的優(yōu)點(diǎn)。scFv 由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽連接而成的單一肽鏈重組蛋白，是具有完全抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片斷，臨床應(yīng)用前景非常廣闊［11，12］。本研究在獲得抗SOST 單克隆抗體基礎(chǔ)上，對(duì)VH 和VL 基因采用RT－PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，并組裝單鏈抗體基因SOST－scFv，采用NCBIblast技術(shù)分析SOST－scFv，同時(shí)構(gòu)建單鏈抗體原核表達(dá)載體SOST－scFv－22b 體系，并對(duì)SOST－scFv－22b 表達(dá)蛋白活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑 單克隆抗體基因序列，pET－22b(+)載體，HEK293 細(xì)胞由課題組制備并凍存。PrimeStarDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶，pMD18－T 載體和瓊脂糖等試劑均購自takara 公司。質(zhì)粒提取試劑盒(BIOMIGA)，膠回收及純化試劑盒(康為世紀(jì))，Trizo1 和反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Roche 公司產(chǎn)品，氯仿、異丙醇、無水乙醇均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，維持培養(yǎng)液和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液均購自美國ScienCell 公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，采用TRIzo1 試劑破碎細(xì)胞后，氯仿抽取、異丙醇沉淀后用75%乙醇洗滌，干燥后用焦碳酸二乙酯處理過的水溶解RNA。以提取的RNA 為模板，按照RT－PCR 試劑盒操作流程要求進(jìn)行合成cDNA。

1.2.2 設(shè)計(jì)引物 依據(jù)兔單克隆抗體的可變區(qū)設(shè)計(jì)VL 和VH 引物，并采用簡并密碼子適應(yīng)輕重鏈的多樣性(S=G，C;M=A，C;R=A，G;W=A，T;Y=C，T);將Linker 設(shè)計(jì)在VL 下游引物和VH 上游引物，兩端設(shè)有Not I 和BamHI 酶切點(diǎn)及保護(hù)性堿基。輕鏈可變區(qū)上游引物VL－F:5'TTCGGATCC GACSCTATGCTRACCCWGACT 3'，5'端畫線處引入了BamH I 酶切位點(diǎn)，輕鏈可變區(qū)下游引物VL－R:5'TGGCTACCGGAGCCACTACCTAGGATCTCCAGCTCGGTCC 3'。重鏈可變區(qū)上游引物VH－F:5'TAGTGGCTCCGGTAGCCAGTCGGTGGAGGAGTCCGG 3';重鏈可變區(qū)下游引物VH－R:5'ATAAgAATGCGGCCGC TGAGRAGYCGGTGAMCAG SGTGCC 3'，5'端畫線處引入了Not I 酶切位點(diǎn)。

1.2.3 V 區(qū)基因克隆及SOST－scFv 基因的構(gòu)建以合成的cDNA 為模板，以VL－F/VL－R，VH－F/VH－R 為引物，分別擴(kuò)增VL、VH 基因，采用DNA 回收純化試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系為:加入1 L 濃度均為20 mol 的引物，并加入1 L cDNA 模板、12.75 L ddH2O、0. 25 L PrimeStarDNA 酶，總體積20 L。以VL－F 和VH－R 為引物，以純化回收的VL和VH 基因片段為模板，通過SOE PCR 擴(kuò)增獲得VL–liner－VH 結(jié)構(gòu)基因片段。反應(yīng)體系:加入2 L 濃度為20 mol 的引物，加入3 L VL 和VH 基因片段、29.5 L ddH2O、0.5 L PrimeStarDNA 聚合酶，總體積50 L。反應(yīng)條件:經(jīng)過95 ℃5 min，95 ℃12 s，49 ℃15 s，72 ℃60 s，5 個(gè)循環(huán)后再進(jìn)行95 ℃5 min，95 ℃12 s，67 ℃15 s，72 ℃60 s，25 個(gè)循環(huán)后再72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后切膠，采用康為世紀(jì)公司凝膠回收試劑盒回收DNA 片段。

1.2.4 SOST－scFv 基因的克隆與鑒定 采用DNA 純化試劑盒回收純化SOST－scFv 基因，引入PMD18－T 載體，并轉(zhuǎn)入HEK293 細(xì)胞，經(jīng)TA 連接及PCR 鑒定陽性克隆菌(命名為pMD18－SOST－scFv)送公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast 分析。

1.2.5 重組載體SOST－scFv 的構(gòu)建、表達(dá)及分析 通過將SOST－scFv 定向克隆到表達(dá)載體PET－22b(+)Not I 及BamH I 酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組pET－SOST－scFv 質(zhì)粒，經(jīng)鑒定(酶切及PCR)為陽性克隆后，將重組質(zhì)粒pET－SOST－scFv 轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主HEK293 細(xì)胞中，挑取其中3 個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定結(jié)果正確的克隆進(jìn)行可溶性蛋白表達(dá)。

1.2.6 SOST－scFv 基因誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組克隆子接種2 YTG 培養(yǎng)液，30 ℃過夜培養(yǎng)，次日按1∶100 接種培養(yǎng)液2YTA，30 ℃培養(yǎng)，待A600 值達(dá)1.0 左右時(shí)，加入IPTG 使其終濃度為1 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.7 SDS－PGAE 評(píng)估SOST－scFv 的表達(dá)293EBNA 細(xì)胞傳代用1 L 的搖瓶，工作體積200 ml，在37 ℃，5% CO2搖床中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)液直接稀釋到要轉(zhuǎn)染的密度。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在搖瓶中放搖床上培養(yǎng)，根據(jù)不同培養(yǎng)體積選擇不同大小的搖瓶或反應(yīng)器。培養(yǎng)過程加料使得細(xì)胞高表達(dá)，然后培養(yǎng)3 ～6 d 后，收集上清液去純化，濃縮，SDS－PAGE 檢測后，－20 ℃冷凍保存。

1.2.8 ELISA 檢測表達(dá)產(chǎn)物抗原結(jié)合活性 分別采用2 μg/ml、10 μg/ml 重組蛋白SOST 包被ELISA板4 ℃過夜后20 g/L BSA 37 ℃條件下封閉。分別加入上清、破碎上清、破碎沉淀，陰性對(duì)照組采用未誘導(dǎo)菌液，37 ℃孵育1 h，以HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 為二抗，37 ℃孵育1 h，TMB 顯色分析。純化后scFv 經(jīng)SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液4 ℃封閉過夜，PBST 洗滌，一抗加入scFv，二抗采用鼠抗SOST 單克隆抗體，三抗羊抗鼠特異性抗體，最后選用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色液顯色，邊搖動(dòng)邊觀察，至條帶清晰后加入雙蒸水終止其反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.2.9 成骨分化實(shí)驗(yàn) 采用茜素紅染色觀察培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化及礦化結(jié)節(jié)的形成情況，實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組維持培養(yǎng)液+ sost 單鏈抗體(50 ng/ml 培養(yǎng)液)，空白組維持培養(yǎng)液，對(duì)照組僅為維持培養(yǎng)液+誘導(dǎo)分化液，持續(xù)培養(yǎng)并觀察14 d，期間每4 ～5 d 更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)14 d，將預(yù)置玻片采用95%乙醇固定10 min，然后用0.1%茜素紅茜素紅－Tris－Hcl(pH 為8.3)染色30 min、PBS沖洗4 次，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞總RNA 提取 如圖1 所示，從單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞5H3D1 中提取的總RNA 經(jīng)電泳檢測，可見明顯的18S、28S 條帶，表明提取的總RNA 良好。

2.2 可變區(qū)基因克隆結(jié)果 以輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)為引物，并采用RT－PCR 合成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出輕鏈和重鏈可變區(qū)基因VL 和VH，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖2 所示VH 基因片段為330 bp 左右，VL 基因片段為340 bp 左右。

2.3 scFv 的構(gòu)建及鑒定 如圖3 所示，純化回收VL、linker 及VH 基因經(jīng)SOE－PCR 擴(kuò)增得到linker連接的scFv 基因(VL– linker－VH )。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，組裝片段大小約為700 bp 左右。將構(gòu)建的scFv 片段插入到PMD－T 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒?？寺〗?jīng)PCR 鑒定，挑選插入條帶與預(yù)期基因片段大小相符的陽性克隆送測序。

圖1 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞提取的總RNA

圖2 PCR 擴(kuò)增scFv 基因

圖3 抗體純化后的電泳鑒定

2.4 VH、VL、scFv 基因序列分析 基因序列分析顯示:VH 和VL 基因符合小鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因特征，均包含3 個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、4 個(gè)框架區(qū)(FR )及具有抗體特征性的2 個(gè)半胱氨酸殘基。所構(gòu)建的scFv 全長687 bp，編碼229 個(gè)氨基酸;VH 基因序列全長330 bp，編碼110 個(gè)氨基酸;VL 基因序列全長339 bp，編碼氨基酸113 個(gè);VL 與VH 基因之間連接結(jié)構(gòu)為linker。VH 基因片段3 端帶有Linker 12 個(gè)堿基的互補(bǔ)序列，5 端帶有BamH I酶切位點(diǎn);VL 基因片段3 端帶有Not I 酶切位點(diǎn)，5 端帶有Linker 30 個(gè)堿基的重疊序列。兩者測序結(jié)果通過GenBank IgB last 數(shù)據(jù)庫在線分析顯示框架區(qū)序列同源性在95%以上，只有抗原互補(bǔ)決定區(qū)有個(gè)別堿基突變。構(gòu)建的SOST－scFv 測序結(jié)果與輕鏈、重鏈序列對(duì)比序列完全一致。

2.5 pET－SOST－scFv 表達(dá)載體構(gòu)建 以轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒pMD18－SOST－scFv 為模板，分別對(duì)重鏈可變區(qū)下游引物VH－R 和輕鏈可變區(qū)上游引物VL－F進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到產(chǎn)物大小為700 bp 左右的目的帶(圖4)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)Not I，BamH I 雙酶切后插入表達(dá)載體PET－22b(+)。挑取PCR 鑒定為陽性的克隆做表達(dá)。

圖4 SOST－scFv 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE 檢測 離心提取包涵體蛋白，經(jīng)尿素梯度溶解、復(fù)性、超濾后通過SDS－PAGE 分析得到相對(duì)純化的sost－scFv 表達(dá)蛋白帶，蛋白分子量大小35KD，與預(yù)計(jì)相符(圖5)。

2.7 表達(dá)產(chǎn)物的ELISA 分析 ELISA 分析顯示，表達(dá)蛋白sost－scFv 可以和SOST 抗原特異結(jié)合(圖6)。

2.8 Western－blot 檢測結(jié)果 Western－blot 檢測證實(shí)scFv 與sost 蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量35 ku 處有一條明顯的特異性反應(yīng)帶，與sost 抗原的分子量大小相符，說明獲得的scFv 可與sost 抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)(圖7)。

2.9 體外誘導(dǎo)分化檢測結(jié)果 茜素紅染色的方法證實(shí)實(shí)驗(yàn)組(抗sost 單鏈抗體)有較多茜素紅染色陽性的鈣化結(jié)節(jié)形成，鈣化結(jié)節(jié)呈橘紅染色;對(duì)照組(誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液)鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組少;而空白組未經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞染色結(jié)果為陰性，未發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)(圖8)。以上結(jié)果顯示抗sost能夠有效促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)與礦化。

圖5 SDS－PAGE 分析純化后scfv 蛋白

圖6 2 μg/ml 的sost－scFv 表達(dá)蛋白可以和SOST 抗原特異結(jié)合

圖7 scFv 表達(dá)的Western－bolt 的分析

圖8 體外誘導(dǎo)分化檢測結(jié)果(茜素紅染色，×100)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥已成為全球范圍內(nèi)普遍關(guān)注的健康問題，由其導(dǎo)致的脆性骨折具有很高的發(fā)病率和病死率，因此關(guān)于骨質(zhì)疏松病因機(jī)制及治療研究已成為生命科學(xué)中富有挑戰(zhàn)性且意義重大的領(lǐng)域。發(fā)掘作用于特定靶點(diǎn)的新型抗骨質(zhì)疏松藥物是當(dāng)今治療骨質(zhì)疏松的重要研究方向［13－15］，而以骨硬化蛋白(sclerostin)為靶點(diǎn)的抗體藥物研發(fā)已成為國際抗骨質(zhì)疏松藥物研究的熱點(diǎn)［16，17］。而與目前SOST 單克隆抗體相比，單鏈抗體具有構(gòu)建表達(dá)方便、結(jié)構(gòu)簡單、組織穿透力強(qiáng)、免疫原性小，以及便于生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景更加廣闊。

scFv 是目前報(bào)道最多的基因工程抗體之一，在多種疾病的診斷中具有非常高的應(yīng)用價(jià)值。本研究選擇具有抗SOST 特異性的高親和力mAb 抗體，克隆其可變區(qū)基因，并在輕鏈可變區(qū)上游引物前加上與linker 重疊的部分，同時(shí)在重鏈可變區(qū)下游引物前端加上12 個(gè)H 鏈鉸鏈區(qū)部分堿基，形成與linker上游互補(bǔ)結(jié)構(gòu);同時(shí)采用SOE－PCR 方法構(gòu)建VL－liner－VH 片段。所得可變區(qū)基因片段經(jīng)過DNA 測序及在線NCBI G enBank 分析比較，證實(shí)所得可變區(qū)重鏈基因和輕鏈基因均為小鼠抗體基因，同源性在90%以上。VL 基因位于linker 上游，VH基因位于linker 下游，scFv 基因全長687bp，序列構(gòu)建正確。

單鏈抗體的免疫學(xué)活性及其表達(dá)量與構(gòu)建方法密切相關(guān)，而VH 和VL 連接順序、Linker 種類、二聚或多聚化傾向性均會(huì)影響單鏈抗體表達(dá)產(chǎn)量及其三維空間構(gòu)象，進(jìn)而影響單鏈抗體生物活性。研究表明，VL－Linker－VH 基因比VH－Linker－VL 表達(dá)量高10 ～20 倍［18，19］，這也是筆者選擇VL－Linker－VH 順序的原因之一。而Linker 的長度、序列對(duì)scFv 的表達(dá)水平、穩(wěn)定性、親和性均有重要作用。本研究選用含有15 個(gè)氨基酸的連接肽(Gly4Ser)3，主要因?yàn)榻z氨酸屬于親水性強(qiáng)的氨基酸，可增加其親水性;而甘氨酸的分子量較小、側(cè)鏈最短，可增加側(cè)鏈的柔性，該處理方法可使scFv 具有更強(qiáng)的生物活性［20］。

常用測定單鏈抗體活性方法包括免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)等，然而由于單鏈抗體缺少抗體恒定區(qū)，因此與完整抗體相比，其活性測定相對(duì)復(fù)雜和困難;最直接的測定方法是制備抗體可變區(qū)的抗體，直接與單鏈抗體反應(yīng)，但方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)。本研究首先純化得到可溶性scFv 蛋白，并通過間接ELISA 法檢測其抗原性。結(jié)果表明誘導(dǎo)的可溶性scFv 蛋白與抗soso 抗體有較好的特異性和親和力。在進(jìn)一步研究中，筆者觀察了抗sost單鏈抗體對(duì)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，較之自然的誘導(dǎo)分化劑，抗sost單鏈抗體能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外成骨礦化能力。但體外實(shí)驗(yàn)并不能完全反映出抗體注入體內(nèi)可能發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)，因此在下一步研究中仍需要?jiǎng)游矬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步檢測單鏈抗體的生物學(xué)活性。而目前制備單鏈抗體存在穩(wěn)定性差、只能與一種抗原特異性結(jié)合、功能單一等不足，如何提高其穩(wěn)定性并進(jìn)一步提高結(jié)合活性及功能，將是進(jìn)一步研究方向。

綜上所述，筆者首次成功構(gòu)建了單鏈抗體scFv的表達(dá)載體，并證實(shí)其表達(dá)的scFv 蛋白具有較好的免疫結(jié)合活性以及較強(qiáng)的體外誘導(dǎo)分化成骨礦化作用，本研究scFv 單鏈抗體的成功制備為骨質(zhì)疏松類疾病治療提供了一種新的思路和方法。

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