曹寶森 李 霞 康 劍云 常 茂葉 張 凡 劉 寶生 王新生

成熟淋巴細(xì)胞歸巢到特定區(qū)域是穿越高內(nèi)皮微靜脈并進(jìn)入外周器官的定向遷移，是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過程，關(guān)鍵步驟包括貼壁、滾動(dòng)，粘附、捕獲及遷移。而腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚，但與淋巴歸巢有相似之處。CD62L表達(dá)上調(diào)在T細(xì)胞貼壁滾動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用。黏膜地址素細(xì)胞粘附分子(MadCAM-1)是外周淋巴結(jié)血管地址素，與相應(yīng)受體的結(jié)合誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的游走和歸巢過程，然而關(guān)于CD62L、Mad-CAM-1在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)研究尚少。筆者通過免疫組化染色分析CD62L、MadCAM-1在非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和正常肺組織、無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，探討CD62L、MadCAM-1表達(dá)與肺癌發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月至2011年12月河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院、河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院住院的手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷為非小細(xì)胞肺癌患者60例，其中腺癌20例，鱗癌24例，腺鱗癌10例，大細(xì)胞未分化癌6例;肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)30例，無肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)30例，正常肺組織30例。所有患者術(shù)前未經(jīng)化療和放療，無其他惡性腫瘤史。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診。

1.2 免疫組化染色 一鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德試劑公司，組織石蠟塊包埋，4 μm連續(xù)切片。主要免疫組化步驟:二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1 h，DAB顯色10～15 min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷:著色細(xì)胞＜10%為陰性，＞10%為陽性。CD62L陽性物質(zhì)定位在腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，MadCAM-1陽性部位定位在高內(nèi)皮微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。采用HIPAS100圖象分析軟件對(duì)所有切片進(jìn)行圖象分析，首先低倍鏡尋找每張切片著色的典型區(qū)域，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場(chǎng)，放大400倍鏡下測(cè)量每個(gè)視場(chǎng)中陽性灰度單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強(qiáng)度(即灰度單位)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同組間表達(dá)率的比較采用Fisher精確概率法，各指標(biāo)在同一組間的表達(dá)水平以及與浸潤程度之間作直線回歸相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD62L的表達(dá)率情況 CD62L在腫瘤組織中表達(dá)在腫瘤細(xì)胞、脈管內(nèi)癌栓、間質(zhì)浸潤的淋巴細(xì)胞;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達(dá)在轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞、脈管內(nèi)癌栓以及淋巴細(xì)胞;在正常肺組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達(dá)在成熟淋巴細(xì)胞;CD62L在癌組織中表達(dá)高于正常肺組織(P＜0.05);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)(P＜0.05);CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)與癌組織中的表達(dá)相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達(dá)與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)無差異(P＞0.05);CD62L在癌組織中陽性表達(dá)率65%(39/60)明顯高于正常肺組織10%(3/30)(P＜0.05);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達(dá)率70%(21/30)明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)陽性表達(dá)率17%(5/30)(P＜0.05);CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)率與癌組織中的表達(dá)率相比無差異(P＞0.05);CD62L在正常肺組織表達(dá)率與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)率無差異(P ＞0.05)。

2.2 MadCAM-1的表達(dá)率情況 MadCAM-1主要表達(dá)淋巴結(jié)濾泡間區(qū)的高內(nèi)皮后微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;在癌組織中的高內(nèi)皮微靜脈無表達(dá);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達(dá)率70%(21/30)高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)率40%(12/30)。

2.3 CD62L、MadCAM-1表達(dá)水平與肺癌臨床病理特征的關(guān)系CD62L的陽性表達(dá)水平(即灰度單位)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、TNM分期之間存在密切相關(guān)，與腫瘤體積、細(xì)胞分化程度、侵犯肺膜無關(guān);MadCAM-1的陽性表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤體積存在明顯相關(guān)，與細(xì)胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關(guān)。見表1。

2.4 CD62L、MadCAM-1表達(dá)水平間的相關(guān)分析 CD62L及其受體MadCAM-1表達(dá)在肺癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)之間存在密切相關(guān)(r=0.7081，P=0.002);CD62L及其受體Mad-CAM-1表達(dá)在肺癌組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)之間不存在相關(guān)(P ＞0.05)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)隔器官的轉(zhuǎn)移是有選擇性而非隨機(jī)的，非常類似淋巴細(xì)胞的歸巢現(xiàn)象，目前有3種理論來解釋這種歸巢現(xiàn)象:(1)選擇性生長(zhǎng)，即腫瘤細(xì)胞從血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)向組織內(nèi)的滲透是廣泛存在的，但只在具有適合的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境中生存。(2)腫瘤細(xì)胞只選擇性地在歸巢器官的內(nèi)皮表面附著生長(zhǎng)。(3)腫瘤細(xì)胞只向產(chǎn)生特異的水溶性的吸附因子的器官趨化。上述機(jī)制在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的轉(zhuǎn)移觀察中或多或少存在，但目前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還無法完全解釋腫瘤細(xì)胞的偏好性轉(zhuǎn)移。

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系±s

表1 CD62L、MadCAM-1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系±s

注:tc代表CD62L;tM代表MadCAM-1

病理參數(shù) CD62L MadCAM-1 t值 P值臨床分期Ⅰ、Ⅱ期(n=36) 26.3 ±3.4 21.0 ±2.2 t c=4.9921 ＜0.05Ⅲ、Ⅳ期(n=24) 42.3 ±3.5 22.4 ±2.0 t M=2.5406 ＞0.05腫瘤直徑(cm)≤3(n=25) 22.3 ±1.7 23.3 ±1.4 t c=2.8451 ＞0.05＞3(n=35) 22.1 ±3.7 34.3 ±3.0 t M=4.6723 ＜0.05分化程度高分化(n=30) 21.0 ±2.1 25.3 ±4.9 t c=2.2917 ＞0.05中、低分化(n=30) 24.2 ±3.0 23.8 ±2.1 t M=2.3453 ＞0.05有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=30) 22.2 ±1.3 21.5 ±2.0 t c=5.6632 ＜0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(n=30) 40.5 ±2.6 40.4 ±1.6 t M=6.3346 ＜0.05有無浸潤未浸潤肺膜(n=35) 22.2 ±1.7 22.2 ±1.9 t c=1.8042 ＞0.05浸潤肺膜(n=25) 21.5 ±2.5 22.5 ±2.6 t M=2.0216 ＞0.05有無脈管內(nèi)癌栓無脈管內(nèi)癌栓(n=32) 21.7 ±2.6 23.2 ±3.7 t c=4.7802 ＜0.05有脈管內(nèi)癌栓(n=28) 32.4 ±4.9 40.2 ±5.0 t M=5.0216 ＜0.05

淋巴細(xì)胞歸巢的關(guān)鍵步驟是貼壁，而CD62L介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的初始粘附在此過程中起關(guān)鍵作用。CD62L又稱淋巴細(xì)胞歸巢受體(lymphocytehoming receptor，LHR)。由Gallatin和Tedder等首先在小鼠淋巴細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，其分子質(zhì)量為140 kD，CD62L分子內(nèi)具有類似凝集素樣的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，通過鈣依賴性方式與細(xì)胞表面糖蛋白相互作用。CD62L表達(dá)于大多數(shù)B細(xì)胞和未致敏T細(xì)胞以及多數(shù)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞［1］。CD62L通過識(shí)別外周淋巴結(jié)高內(nèi)皮靜脈(HEV)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的外周淋巴結(jié)地址素(peripheral node addressins，PNAd)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢到外周淋巴結(jié)。CD62L的正常功能是作為淋巴細(xì)胞到達(dá)外周淋巴結(jié)的歸巢受體［2］。而Alcaide等用胰島素啟動(dòng)子調(diào)控猴病毒40T抗原表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生特異向肝臟轉(zhuǎn)移的胰島β細(xì)胞瘤，沒有淋巴轉(zhuǎn)移;而在胰島啟動(dòng)子調(diào)控下同時(shí)表達(dá)猴病毒40T抗原和L-選擇素的轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生特異性向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰島β細(xì)胞瘤，且這種轉(zhuǎn)移能被L-選擇素蛋白的抗體所阻斷［3］，說明L-選擇素可協(xié)助腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞表面有CD62L的表達(dá)，可協(xié)助腫瘤細(xì)胞與淋巴結(jié)黏附，從而可能介導(dǎo)向淋巴道轉(zhuǎn)移。采用單引物擴(kuò)增法標(biāo)記的基因芯片技術(shù)篩選乳腺原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)CD62L在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)上調(diào)［4，5］。CD62L在腫瘤組織中表達(dá)在腫瘤細(xì)胞、脈管內(nèi)癌栓、間質(zhì)浸潤的淋巴細(xì)胞;在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達(dá)在轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞、脈管內(nèi)癌栓以及淋巴細(xì)胞;在正常肺組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要表達(dá)在成熟淋巴細(xì)胞;CD62L在癌組織中表達(dá)高于正常肺組織;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá);CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)與癌組織中的表達(dá)相比無差異;CD62L在正常肺組織表達(dá)與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)無差異;CD62L在癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于正常肺組織;轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達(dá)率明顯高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)陽性表達(dá)率;CD62L在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)率與癌組織中的表達(dá)率相比無差異;CD62L在正常肺組織表達(dá)率與無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)率無差異;相關(guān)分析顯示:CD62L的陽性表達(dá)水平(即灰度單位)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、TNM分期之間存在密切相關(guān)，與腫瘤體積、細(xì)胞分化程度、侵犯肺膜無關(guān);說明CD62L不僅介導(dǎo)正常肺組織間質(zhì)慢性炎癥中淋巴細(xì)胞的歸巢，而且參與肺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)CD62L表達(dá)粘附到內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)入脈管系統(tǒng)形成癌栓;同時(shí)隨腫瘤臨床分期的增加，血管新生更加明顯，管壁的不完整和低壓力便利腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng);同時(shí)我們?cè)囼?yàn)也觀察到表達(dá)CD62L的腫瘤細(xì)胞分布大多臨近血管豐富區(qū)域，并且脈管內(nèi)癌栓的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)弱不等現(xiàn)象，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)較強(qiáng)，而腫瘤組織脈管中癌栓表達(dá)較弱，推測(cè)CD62L的表達(dá)水平與其所處的狀態(tài)密切相關(guān)，位于腫瘤組織內(nèi)的癌栓低表達(dá)，便利腫瘤細(xì)胞脫離初期與內(nèi)皮細(xì)胞粘附而進(jìn)入血流;淋巴結(jié)中的過表達(dá)便利腫瘤細(xì)胞與HEV的內(nèi)皮細(xì)胞粘附游出脈管，完成最終的轉(zhuǎn)移。

MadCAM-1是一種未分類的細(xì)胞粘附分子，主要表達(dá)在HEV的內(nèi)皮細(xì)胞，與相應(yīng)的受體CD62L結(jié)合介導(dǎo)黏膜相關(guān)組織的淋巴細(xì)胞的歸巢。有研究發(fā)現(xiàn)炎性腸病患者粘膜下淋巴小結(jié)內(nèi)以及固有層內(nèi)的高內(nèi)皮微靜脈過表達(dá)，而敲除Mad-CAM-1基因的小鼠免疫力低下，甚至于胚胎期死亡［6，7］。在大腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的表達(dá)降低，而且與腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤程度密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于無下降組，但與脈管內(nèi)癌栓以及新生血管密度無明顯相關(guān)，而且在胃癌研究中未發(fā)現(xiàn)MadCAM-1的下降［8，9］。乳腺癌樣本中研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者同時(shí)存在腫瘤周圍高內(nèi)皮微靜脈樣變，而且轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)的HEV內(nèi)皮高表達(dá)MadCAM-1，而且脈管內(nèi)癌栓發(fā)生率明顯高于低表達(dá)組［10］。因此推測(cè)腫瘤細(xì)胞借助Mad-CAM-1的趨化作用，粘附表達(dá)相應(yīng)抗體或被表達(dá)相應(yīng)抗體免疫細(xì)胞包繞的癌栓，在進(jìn)入脈管系統(tǒng)和穿出脈管系統(tǒng)等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，完成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。我們的研究顯示MadCAM-1主要表達(dá)淋巴結(jié)濾泡間區(qū)的高內(nèi)皮后微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;在癌組織中的高內(nèi)皮微靜脈無表達(dá);轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)率。MadCAM-1的陽性表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤體積存在明顯相關(guān)，與細(xì)胞分化、侵犯肺膜、腫瘤分期無明顯相關(guān)。說明MadCAM-1在血管內(nèi)皮表達(dá)參與肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其與表達(dá)受體CD62L的腫瘤細(xì)胞或被免疫細(xì)胞包繞表達(dá)CD62L的癌栓結(jié)合，介導(dǎo)脈管內(nèi)的腫瘤細(xì)胞粘附到表達(dá)地址素的HEV，穿越血管進(jìn)入淋巴結(jié)，完成轉(zhuǎn)移。同時(shí)隨腫瘤體積增加，新生血管增多，進(jìn)入脈管形成癌栓機(jī)會(huì)增多，在淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶的機(jī)會(huì)增加。

CD62L及其受體MadCAM-1表達(dá)在肺癌組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)之間存在密切相關(guān);CD62L及其受體MadCAM-1表達(dá)在肺癌組織以及無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)之間不存在相關(guān)。說明兩者在肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中其協(xié)同作用，可能是腫瘤細(xì)胞過表達(dá)CD62L的同時(shí)，通過某種機(jī)制同時(shí)上調(diào)HEV內(nèi)皮細(xì)胞MadCAM-1的表達(dá)，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移奠定分子基礎(chǔ)，使淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生幾率增加。

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