劉少靜 王 黎 楊 黎彬 王 小寧 楊陽(yáng)

竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參Panax japonicus C.A.Meyer的干燥根莖，以根狀莖和肉質(zhì)根入藥，主產(chǎn)于云南、貴州、四川、湖北等省。竹節(jié)參主要藥理活性成分包括竹節(jié)人參皂苷、人參皂苷、三七皂苷，其藥理作用和臨床應(yīng)用已引起研究者的普遍關(guān)注［1，2］。目前國(guó)內(nèi)外人參皂苷的測(cè)定方法主要有比色法、薄層光密度法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。經(jīng)比較，高效液相色譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、較易推廣等優(yōu)點(diǎn)［3，4］。為此，該研究建立了以人參皂苷Rg1為質(zhì)控指標(biāo)，采用RP-HPLC定量分析竹節(jié)參中人參皂苷Rg1的含量，為評(píng)價(jià)竹節(jié)參質(zhì)量及進(jìn)一步研究提供一定依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-6AD系統(tǒng)高效液相色譜儀(日本島津公司);FA1004B電子天平(0.1 mg，上海越平科學(xué)儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);L-550臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)

1.2 試藥 人參皂苷Rg1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度:98%);乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為超純水，其他試劑均為分析純。竹節(jié)參藥材(由西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室馮永輝副教授鑒定)。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，置量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得濃度為1 000 μg/ml的對(duì)照品母液。精密吸取一定量母液，加乙腈定容配制成濃度分別為 500、400、250、100、50、25 μg/ml的系列對(duì)照品溶液，4℃冷藏備用。

1.3.2 供試品溶液的制備:精密稱取粉碎后過(guò)40目篩的竹節(jié)參藥材粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇適量，室溫下超聲提取60 min，抽濾，收集濾液，于水浴蒸干，殘?jiān)靡译嫒芙獠⒍ㄈ葜?5 ml量瓶中。4 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)膜，既得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件:色譜柱:Venusil ABS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相采用乙腈:水溶液=21∶79;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;柱溫:25℃;流速:1.0 ml/min;進(jìn)樣量:10 μl。見圖 1。

圖1 人參皂苷Rg1及竹節(jié)參樣品HPLC圖A:對(duì)照品;B:供試品;1:人參皂苷Rg1

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取系列對(duì)照品溶液各10 μl，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。見表1。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果 n=6

2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取250 μg/ml對(duì)照品溶液10 μl，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得人參皂苷Rg1峰面積的RSD為1.26%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精 密稱取同一批樣品5份，各0.1 g，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 5 份，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)得人參皂苷 R g1峰面積的 R SD為2.31%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精 密吸取同一供試品溶液10 μl，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參皂苷 R g1 峰面積的RSD為1.83%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精 密稱取已知含量的竹節(jié)參樣品粉末5份，每份約0.05 g，分別加入人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，依法制成供試品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析。測(cè)得人參皂苷Rg1加樣回收率的平均值及RSD。見表2。

2.6 樣品含量測(cè)定 精 密吸取竹節(jié)參供試品溶液10 μl，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸鹽緩沖液、甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相對(duì)供試品進(jìn)行分離，結(jié)果表明乙腈-水分離效果及峰形均較好。人參皂苷Rg1對(duì)乙腈十分敏感，為避免樣品中雜質(zhì)的干擾，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定乙腈-水最佳配比為21∶79。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果n=5

表3 竹節(jié)參中人參皂苷Rg1含量測(cè)定結(jié)果

3.2 提取工藝的優(yōu)化 以人參皂苷Rg1的提取率為指標(biāo)，綜合考察提取溶劑、溶劑用量、溶劑濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以15倍量的50%甲醇室溫下超聲60 min即可基本提取完全。

本研究采用RP-HPLC檢測(cè)法，結(jié)合乙腈-水溶液洗脫，可準(zhǔn)確、快速定量測(cè)定竹節(jié)參中人參皂苷Rg1的含量，為竹節(jié)參提供了質(zhì)量控制依據(jù)。結(jié)果人參皂苷Rg1含量為65.98 mg/g。

1 李露，程薇，楊潔.高效液相色譜法測(cè)定竹節(jié)參中多種人參皂苷含量.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2008，14:19-22.

2 尹文仲，童學(xué)飛，陳科力.不同海拔條件下竹節(jié)參中人參皂苷含量的比較.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2006，23:12-14.

3 郝桂彤，李紅艷，韓振爽.高效液相色譜法測(cè)定定風(fēng)止痛片中人參皂苷 R g1 的含量.天津藥學(xué)，2011，23:22-24.

4 賈桂艷，馬莉，韓峰.HPLC法測(cè)定舒腦心膠囊中人參皂苷Rg1.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30:41-42.