傅大莉 張婭莉 唐大軒 陳慧潑 徐建兵，4 譚正懷△

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州646000；3.成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，四川 成都610101；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075）

近年來，糖尿病發(fā)病率迅速增長(zhǎng)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示：全球糖尿病患者人數(shù)已超過1.77億，預(yù)計(jì)到2025年將達(dá)到3.7億［1］；其中Ⅱ型糖尿病占90%以上。糖尿病的主要危害來源于其并發(fā)癥，特別是慢性并發(fā)癥，因此積極尋找有效防治糖尿病慢性并發(fā)癥的方法或藥物已成為廣大醫(yī)藥工作者的當(dāng)務(wù)之急。玉泉丸來源于宋代《仁齋直指》，由葛根、天花粉、地黃、麥冬、五味子、甘草等組成。方中以粉葛根生津止渴，主消渴，為君藥；天花粉、地黃滋陰清熱，生津止渴，為臣藥；麥冬清肺養(yǎng)陰，益胃生津，適用于肺胃氣陰不足，舌干口燥，又能清心除煩，為佐藥；五味子益氣生津，寧心止煩渴，全方等藥配合功能養(yǎng)陰生津、止渴除煩、益氣和中，適用于消渴病，肺胃陰虧，熱病后期。該方有養(yǎng)陰生津，止渴除煩，益氣和中的功效。臨床用于糖尿病慢性并發(fā)癥的防治取得較好療效，本文擬運(yùn)用皮下注射谷氨酸鈉（MSG）誘導(dǎo)肥胖大鼠等模型探討玉泉丸防治Ⅱ型糖尿病所致慢性并發(fā)癥的相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試藥

微量注射系統(tǒng)（EICOM CORP，ESP－64C，日本生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀（Denley dragon wellscan MK2，芬蘭Labsystems生產(chǎn)）；UV－730半自動(dòng)生化分析儀（日本島津生產(chǎn)）；血糖測(cè)定儀及配套試紙（羅氏卓越型血糖測(cè)定儀，試紙批號(hào)：470398）。玉泉丸（黃褐色粉末物，每克藥粉相當(dāng)于1.4548g原生藥，批號(hào)：S－110701，由成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司提供），給藥劑量以原生藥g·kg－1表示。臨用前用0.25%CMC－Na配成所需濃度的混懸液備用；羅格列酮片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20030569，批號(hào)：111004，成都恒瑞制藥有限公司出品），臨用前用0.25%CMC－Na配成所需濃度的混懸液備用；鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：1883－66－4，Sigma公司生產(chǎn)），臨用前用pH4.2檸檬酸鹽緩沖液配制成所需濃度的溶液備用。胰島素注射液（速效，國(guó)藥準(zhǔn)字：H32020614，規(guī)格：10ml：400單位，批號(hào)：1112226，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；谷氨酸鈉（MSG，LR，批號(hào)：090412，中國(guó)惠世生化試劑有限公司生產(chǎn)），臨用前用無菌注射用水配成所需濃度的溶液備用；注射用10%葡萄糖（國(guó)藥準(zhǔn)字：H53020473，規(guī)格500 ml：50g，批號(hào)：C120202，昆明南疆制藥有限公司生產(chǎn)）；大鼠胰島素檢測(cè)試劑盒（Rat Insulin Elisa，批號(hào)：20337，Mercodia生產(chǎn)）；低密度膽固醇（LDL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20120229，北京北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)）；高密度膽固醇（HDL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20120220，北京北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)）；總膽固醇（TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20120420，北京北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)）；甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20110824，北京北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SD大鼠（SPF級(jí)，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（川2008－19號(hào)），由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)（合格證號(hào)為SYXK（川）2008－100），室內(nèi)溫度20～22℃，相對(duì)濕度52%左右，照明12小時(shí)明亮，12小時(shí)黑暗。

1.2 方法

1.2.1 玉泉丸對(duì)谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠胰島素敏感性的影響

在大鼠出生次日皮下注射5.0g·kg－1MSG，隔天一次，共三次［2］，8周齡時(shí)將肥胖動(dòng)物（♀♂兼用）隨機(jī)分為模型組、玉泉丸12.0、6.0、3.0g·kg－1組、羅格列酮2.7mg·kg－1組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組。對(duì)照組和模型組給予等體積的0.25%CMCNa，每天灌胃給藥一次，連續(xù)4w。末次給藥后24h并禁食不禁水5h，測(cè)定動(dòng)物體長(zhǎng)及體重，并計(jì)算其Lee′s指數(shù)（Lee′s指然后采用血糖鉗技術(shù)測(cè)定其胰島素敏感性，具體操作為：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50mg·kg－1麻醉后，在保溫板上固定好，75%乙醇消毒，用事先準(zhǔn)備好的滅菌器械切開右頸皮膚，分離右頸靜脈，插入留置針，動(dòng)物肝素化抗凝，縫合并固定。用75%乙醇消毒，切開大鼠左側(cè)大腿皮膚，分離左股動(dòng)脈，插入預(yù)先用肝素鈉處理過的細(xì)管，固定好后待用。將插入右頸靜脈的留置針與三通管相連，另外兩端分別與輸注胰島素和葡萄糖的輸液器相連。實(shí)驗(yàn)前股動(dòng)脈取1ml血液，離心，取血漿放入－20℃冷凍室用于測(cè)定胰島素水平，同時(shí)用血糖測(cè)定儀測(cè)定基礎(chǔ)血糖兩次。然后以恒定的速率（IIR）8mU·（kg·min）－1輸注胰島素，之后每10min測(cè)定一次血糖，當(dāng)血糖值低于5.0mmol·L－1時(shí)，開始同時(shí)輸注10%葡萄糖，并根據(jù)血糖值不斷調(diào)整葡萄糖輸注速率（Glucose infusion rate，GIR），GIR＝10%葡萄糖濃度（mg·ml－1）×葡萄糖輸入量（ml）／體重（kg）×?xí)r間（min），使血糖控制在5.0±0.5mmol·L－1，90min后，連續(xù)測(cè)定5次血糖值在此范圍，即認(rèn)定達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)［3］。

1.2.2 對(duì)高脂＋鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響

取體重為200～240g的♂大鼠，隨機(jī)分為高脂組和正常對(duì)照組。對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，高脂組在給予高脂飼料（含豬油15g、膽固醇4g、膽鹽1g、蛋黃粉5g，基 礎(chǔ)飼料75g）1m后，選擇血脂升高的大鼠在禁食24h后，腹腔注射STZ 20mg·kg－1，測(cè)定72h后的血糖值，選擇血糖值大于13.7mmol·L－1的大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，將合格的大鼠隨機(jī)分為模 型 組、玉 泉 丸 12.0、6.0、3.0g·kg－1組，羅 格 列 酮2.7mg·kg－1組，對(duì)照組和模型組給予等體積的0.25%CMCNa，每天灌胃給藥一次，連續(xù)4w。末次給藥后24h并禁食過夜后腹主動(dòng)脈取血測(cè)定其血清LDL、HDL、TC、TG等指標(biāo)，并計(jì)算其VLDL。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 玉泉丸對(duì)谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠胰島素敏感性的影響

由表1可見，MSG大鼠血糖水平升高，Lee′s指數(shù)增加，胰島素水平升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。玉泉丸3.0g·kg－1可顯著降低MSG大鼠血糖水平，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；玉泉丸12.0g·kg－1有降低 MSG大鼠血糖、胰島素以及Lee′s指數(shù)的趨勢(shì)，但作用較弱，與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

恒速輸注胰島素速率為8mU·（kg·min）－1，穩(wěn)態(tài)血糖濃度為5.0±0.2mmol·L－1，為維持穩(wěn)態(tài)其 GIR值各組之間有極其顯著性差異。從表2可見，MSG肥胖大鼠GIR顯著降低，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；玉泉丸各劑量組可顯著增加MSG大鼠GIR，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 玉泉丸對(duì)MSG誘導(dǎo)的肥胖大鼠血漿胰島素、血糖濃度的影響（±s，n＝6）

表1 玉泉丸對(duì)MSG誘導(dǎo)的肥胖大鼠血漿胰島素、血糖濃度的影響（±s，n＝6）

注：與模型對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑 量（g·kg－1）胰島素濃度（μg·L－1）血糖水平（mmol·L－1）Lee′s指數(shù)（g·cm－1）空白對(duì)照 － 1.8±1.0＊ 5.6±0.3＊ 298.8±8.5＊＊模型對(duì)照 － 4.3±2.3 6.5±0.6 328.7±16.8玉泉丸 3.0 4.3±2.5 5.3±0.6＊＊ 330.1±9.4玉泉丸 6.0 4.6±2.1 6.3±0.6 320.8±14.4玉泉丸 12.0 3.7±1.6 5.8±0.5 317.2±11.3羅格列酮 2.7mg·kg－1 1.9±0.6＊ 5.6±0.5＊326.2±22.6

表2 玉泉丸對(duì)MSG誘導(dǎo)的肥胖大鼠GIR的影響（±s，n＝6）

表2 玉泉丸對(duì)MSG誘導(dǎo)的肥胖大鼠GIR的影響（±s，n＝6）

注：與模型對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑 量（g·kg－1）穩(wěn)態(tài)血糖（mmol·L－1）IIR（mU·（kg·min－1）GIR（mg·（kg·min－1）空白對(duì)照 － 5.0±0.2 8.0 8.6±2.4＊＊模型對(duì)照 － 5.0±0.2 8.0 2.6±1.0玉泉丸 3.0 5.0±0.2 8.0 5.6±1.8＊＊玉泉丸 6.0 5.0±0.2 8.0 6.3±2.3＊＊玉泉丸 12.0 5.0±0.2 8.0 9.3±3.6＊＊羅格列酮 2.7mg·kg－1 5.0±0.2 8.0 9.2±3.4＊＊

2.2 對(duì)高脂＋鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響

由表3可見，Ⅱ型糖尿病大鼠血清TG、TC以及HDL顯著升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。玉泉丸3.0g·kg－1可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清TC以及LDL水平，玉泉丸6.0g·kg－1可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清TC、HDL以及LDL水平，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；玉泉丸各劑量組均有降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清TG的趨勢(shì)，但作用較弱，與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 玉泉丸對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

表3 玉泉丸對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

注：與模型對(duì)照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑 量（g·kg－1）TG（mmol·L－1）TC（mmol·L－1）HDL（mmol·L－1）LDL（mmol·L－1）VLDL（mmol·L－1）空白對(duì)照 － 0.51±0.40＊＊ 1.61±0.32＊＊ 0.72±0.19＊0.32±0.20 0.57±0.30模型對(duì)照 － 1.29±0.39 2.51±0.52 0.95±0.07 0.62±0.29 0.94±0.44玉泉丸 3.0 0.87±0.36 1.79±0.48＊ 0.91±0.18 0.20±0.29＊ 0.68±0.38玉泉丸 6.0 0.92±0.62 1.64±0.41＊＊ 0.72±0.11＊＊ 0.02±0.32＊＊ 0.94±0.25玉泉丸 12.0 0.94±0.59 2.42±0.38 1.15±0.87 0.36±0.19 0.91±0.88羅格列酮 2.7mg·kg－1 0.66±0.34＊ 2.23±0.42 0.77±0.16＊0.56±0.46 0.89±0.31

3 討論

胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的主要特征之一，是指外周組織對(duì)胰島素的敏感性及反應(yīng)性降低，導(dǎo)致胰島素生物學(xué)效應(yīng)下降。研究顯示胰島素抵抗與其諸多糖尿病慢性并發(fā)癥密切相關(guān)：可通過增強(qiáng)血管平滑肌極低密度脂蛋白受體活力，使內(nèi)源性膽固醇合成增多，并提高了多種生長(zhǎng)因子活性，使平滑肌和結(jié)締組織增生，從而直接導(dǎo)致動(dòng)脈硬化；胰島素抵抗可導(dǎo)致LDL和甘油三脂增高，使大動(dòng)脈容易產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化；還與多種血漿和組織蛋白發(fā)生非酶糖化，如糖化血紅蛋白、糖化脂蛋白、糖化膠原蛋白，自由基產(chǎn)生增多，糖化終末產(chǎn)物（AGE）的積聚從而導(dǎo)致微血管病變［4］。上述病變因累及的部位不同而出現(xiàn)不同的并發(fā)癥，當(dāng)累及腎臟時(shí)即可導(dǎo)致糖尿病腎病；當(dāng)累及心臟時(shí)即可出現(xiàn)糖尿病心臟病；當(dāng)累及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)血管時(shí)即可導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病變等等。

谷氨酸鈉（MSG）誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型具有顯著胰島素抵抗特性：高胰島素血癥，后期常出現(xiàn)高血糖，與臨床上的Ⅱ型糖尿病的發(fā)病情況極為相似［2］。本研究采用正糖鉗技術(shù)評(píng)價(jià)其胰島素敏感性，同時(shí)檢測(cè)其血清胰島素及血糖水平，其結(jié)果顯示MSG所誘導(dǎo)的大鼠模型在其3月齡時(shí)表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗，而玉泉丸可顯著改善其胰島素敏感性。

脂質(zhì)代謝紊亂不僅與糖尿病性大血管病變有關(guān)，而且與糖尿病微血管病變密切相關(guān)［5］。有研究顯示：糖尿病血管病變組與無血管病變組相比脂代謝紊亂、胰島素抵抗更明顯，患者胰島素抵抗與脂代謝異常密切相關(guān)，空腹血糖水平與血脂異常程度相關(guān)［6］。臨床上證實(shí)，在Ⅱ型糖尿病的亞臨床期就已存在血脂異常，其中LDL是除血壓以外的導(dǎo)致糖尿病患者發(fā)生血管病變的危險(xiǎn)因素之一，它是Ⅱ型糖尿病脂代謝異常的主要特點(diǎn)［7］。LDL顯著增高，自動(dòng)氧化糖基化過程增強(qiáng)，氧化LDL能被巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集，形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化；糖化LDL可直接與血管基質(zhì)蛋白結(jié)合，使基底膜增厚，血管壁彈性降低，氧化LDL和糖化LDL均能直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加凝血酶原活性，刺激血小板聚集，導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生。

本研究采用高脂加STZ復(fù)制的Ⅱ型糖尿病大鼠模型，其血清TG、TC顯著升高，LDL也有所升高，玉泉丸則可顯著降低Ⅱ型糖尿病大鼠血清TC以及LDL水平。

上述結(jié)果提示：玉泉丸一方面可通過改善胰島素敏感性發(fā)揮其防治糖尿病慢性并發(fā)癥的作用，另一方面也可通過調(diào)節(jié)血脂代謝改善糖尿病患者大血管病變以及微血管病變，為臨床應(yīng)用該藥以改善糖尿病慢性并發(fā)癥提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)，其詳細(xì)作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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3 丁世英，申竹芳，陳躍騰，等.血糖鉗技術(shù)評(píng)價(jià)兩種胰島素抵抗動(dòng)物模型［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2001，9（5）：31－34.

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