張虎山 路會俠 熊文碧 劉偉 吳琦△

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫研究室，四川 成都610041；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都610041）

上皮細(xì)胞是宿主與細(xì)菌相互接觸的前沿，除了物理屏障功能，作為宿主防御病原體感染的第一道防線，上皮細(xì)胞有復(fù)雜的免疫防御及炎癥反應(yīng)機(jī)制。肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種重要的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，能引起疾病的發(fā)生。從泌尿道到呼吸道，肺炎克雷伯桿菌感染的發(fā)病率都很高，且在臨床上易反復(fù)發(fā)作。

吞噬細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞）在吞噬病原微生物后發(fā)生“呼吸爆發(fā)”（Respiratory burst），產(chǎn)生大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）或活性氮（RNI），以活性氧或者活性氮破壞微生物核算、蛋白等來殺滅細(xì)菌，是重要的殺菌機(jī)制［1－2］。細(xì)菌進(jìn)入上皮細(xì)胞無論在體外培養(yǎng)細(xì)胞模型或體內(nèi)細(xì)菌感染都是重要生物學(xué)現(xiàn)象，并與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。迄今研究提示，上皮細(xì)胞能對抗進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，但其中涉及哪些分子機(jī)理，仍然缺乏深入探討。本研究以肺炎克雷伯桿菌感染 T24細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停褂?TNF－α、IFN－γ、IL－1β等重要炎癥細(xì)胞因子，初步探討膀胱上皮細(xì)胞對抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺炎克雷伯桿菌（Klebsiellapneumoniae，KP）編號K5株，為臨床尿路感染分離株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。人膀胱上皮細(xì)胞株 T24為本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞因子 TNF－α、IFN－γ、IL－1β為PeproTech公司產(chǎn)品。1640細(xì)胞培養(yǎng)基，非必需氨基酸購自Gibco公司。LB培養(yǎng)基為Oxoid公司產(chǎn)品。胎牛血清購自蘭州民海公司產(chǎn)品。胰蛋白酶購自Merck公司。過氧化氫酶（Catalase CATA），一氧化氮合酶抑制劑（L－NAME），Triton X－100購自Sigma。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

T24細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（無抗生素），37℃5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入快速生長期，以1.2×105·孔－1接種于 24 孔板，待細(xì)胞融合時(shí)（約 2.5×105·孔－1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

從LB平板中挑取肺炎克雷伯桿菌K5株單個(gè)菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)·min－1振蕩培養(yǎng)3h，取100μl菌液鋪于LB固體培養(yǎng)板，倒置于37℃孵箱，培養(yǎng)16h后收集活菌，紫外分光光度計(jì)測定650nm OD值確定細(xì)菌數(shù)量，用RPMI－1640培養(yǎng)基將細(xì)菌稀釋到適當(dāng)濃度。

1.2.3 細(xì)菌感染入侵T24細(xì)胞

用PBS洗T24細(xì)胞三次，每孔加入細(xì)菌懸液500μl，細(xì)菌數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比例為100∶1，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組為3復(fù)孔。讓細(xì)菌與T24細(xì)胞共孵育2h，采用含慶大霉素（100μg·ml－1）培養(yǎng)基孵育2h殺滅細(xì)胞外的細(xì)菌，分別在加入細(xì)菌后的4、8、18、24h用0.25%Triton X－100裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量（將裂解液作10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋樣品涂2個(gè)LB平板，置于37℃溫箱中培養(yǎng)，24h后計(jì)數(shù)菌落）。

1.2.4 細(xì)胞因子對T24細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量的影響

K5株細(xì)菌與T24細(xì)胞共孵育2h，用PBS洗T24細(xì)胞三次，加入含有慶大霉素的1640培養(yǎng)基孵育2h殺滅細(xì)胞外細(xì)菌，然后加入含不同濃度細(xì)胞因子（TNF－α、IFN－γ或IL－1β）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)菌感染細(xì)胞后的24及48h，以Triton X－100裂解細(xì)胞，平板菌落計(jì)數(shù)法確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。

1.2.5 過氧化氫酶（CATA）、L－NAME對細(xì)胞因子刺激的抗菌作用的影響

K5株細(xì)菌與T24細(xì)胞共孵育2h，用PBS洗T24細(xì)胞三次，加入含有慶大霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基孵育2h殺滅細(xì)胞外細(xì)菌，然后加入含CATA或L－NAME的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞1h，再加入同時(shí)含細(xì)胞因子及抑制劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h裂解細(xì)胞，確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)值以±s表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 K5株細(xì)菌在T24細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，K5株細(xì)菌進(jìn)入T24細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)生長，以細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞后8h胞內(nèi)活菌數(shù)量最多，以后緩慢減少。8、18、24h細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量分別比4h增加36%、34%、22%，見圖1。

圖1 細(xì)菌內(nèi)活菌隨時(shí)間變化趨勢

2.2 TNF－α對T24細(xì)胞抗菌活性的影響

在細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞后，分別以5、10、20ng·ml－1TNF－α作用于細(xì)胞。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)24h，TNF－α20ng組細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量明顯低于實(shí)驗(yàn)對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異（P＜0.01），TNF－α5ng組、10ng組細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量與對照組相比無顯著差異。在實(shí)驗(yàn)48h，TNF－α10ng、20ng組細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量低于對照組（P＜0.01），5ng組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。說明使用TNF－α可以促進(jìn)膀胱上皮細(xì)胞殺滅胞內(nèi)K5株細(xì)菌，并呈濃度依賴關(guān)系，見圖2。

圖2 TNF－α對細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量的影響

2.3 聯(lián)合使用TNF－α和IFN－α對T24細(xì)胞抗菌活性的影響

與空白對照組相比，TNF－α（20ng· ml－1）和INF－γ（20ng·ml－1）聯(lián)合使用組在12h、24h、48h細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量分別減少36.1%、74.1%、94.4%。結(jié)果說明 使用 TNF－α和INF－γ能更加顯著地促進(jìn)T24細(xì)胞清除胞內(nèi)的細(xì)菌，提示這兩種細(xì)胞因子聯(lián)合使用可能存在協(xié)同效應(yīng)，見圖3。

圖3 聯(lián)合使用TNF－α和IFN－α對T24細(xì)胞抗菌活性的影響

2.4 CATA、L－NAME對細(xì)胞因子刺激的抗菌作用的影響

實(shí)驗(yàn)24h裂解細(xì)胞，平板菌落計(jì)數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)結(jié)果顯示：TNF－α＋I(xiàn)NF－γ＋CATA 組與 TNF－α＋I(xiàn)NF－γ組比較，24h細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)增加了3.16倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著意義（P＜0.01），表明CATA能夠抑制由 TNF－α＋I(xiàn)NF－γ刺激產(chǎn)生的T24細(xì)胞抗菌活性。L－NAME對細(xì)胞因子刺激的抗菌作用無明顯影響。結(jié)果見圖4。

圖4 CATA、L－NAME對K5在TNF－α＋I(xiàn)NF－γ刺激后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的影響

2.5 IL－1β對T24細(xì)胞抗菌作用的影響

在實(shí)驗(yàn)24h，實(shí)驗(yàn)各組之間細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。在實(shí)驗(yàn)48h，IL－1β5ng、10ng組與空白對照組無顯著差異（P＞0.05），IL－1β20ng組比空白對照組細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量有一定程度減少（P＜0.05），說明IL－1β僅在較高濃度（20ng·ml－1）對膀胱上皮細(xì)胞抗菌作用有輕微的促進(jìn)作用，見圖5。

3 討論

早在20世紀(jì)60年代，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，即使把大量的大腸桿菌直接注入豚鼠、大鼠、兔膀胱（甚至有實(shí)驗(yàn)把大腸桿菌注入到人的膀胱），結(jié)果并不能造成慢性尿路感染，經(jīng)過72h，膀胱已清除注入的細(xì)菌［3－6］。正常膀胱粘膜究竟是如何清除這些細(xì)菌的呢，這是一個(gè)值得深究的問題。

近年來研究提示，通過與細(xì)菌的直接接觸，或者吞噬攝取細(xì)菌，上皮細(xì)胞也許有與吞噬細(xì)胞同樣重要的抗菌作用。Deitch［7］的實(shí)驗(yàn)顯示與銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞對這些細(xì)菌有很強(qiáng)的殺菌活性（甚至強(qiáng)過中性粒細(xì)胞）。Dolapci［8］的研究則展現(xiàn)了口腔粘膜上皮細(xì)胞對鏈球菌的抗菌能力。Schulte－Wissermann［9］與 Schofer［10］觀察到大腸埃希菌與正常人尿液中脫落的上皮細(xì)胞接觸后死亡，而來自反復(fù)尿路感染患者的尿液脫落上皮細(xì)胞缺乏類似的抗菌活性。最近，Mulvcy［11］在以小鼠為模型的研究中發(fā)現(xiàn)，尿路致病性大腸埃希菌進(jìn)入膀胱上皮細(xì)胞，并可以在細(xì)胞內(nèi)生長，形成細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌集團(tuán)（Intracellular bacterial communities，IBC），這個(gè)現(xiàn)象可能有助于細(xì)菌逃避宿主免疫防御，成為尿路感染容易反復(fù)發(fā)作的原因。然而注入小鼠膀胱的細(xì)菌達(dá)到108，在每個(gè)膀胱中只觀察到數(shù)十個(gè)胞內(nèi)細(xì)菌集團(tuán)，提示膀胱上皮細(xì)胞存在抗菌功能，大多數(shù)細(xì)菌生長被限制。

圖5 IL－1β不同濃度對T24細(xì)胞抗菌影響

我們采用臨床分離的肺炎克雷伯桿菌K5株感染T24細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在T24細(xì)胞內(nèi)早期有一定程度的生長（細(xì)菌數(shù)量增加一般不超過1倍），以后即逐漸減少。這表明在沒有任何刺激的情況下，膀胱上皮細(xì)胞有效限制了胞內(nèi)細(xì)菌的生長，并可能逐漸將它們清除。本試驗(yàn)結(jié)果與Tobias等［12］的報(bào)道相似，他們的研究顯示肺炎克雷伯桿菌進(jìn)入T24細(xì)胞后在24h內(nèi)細(xì)菌數(shù)量有輕微增加，以后則逐漸減少。

對于上皮細(xì)胞限制胞內(nèi)細(xì)菌生長或殺滅胞內(nèi)細(xì)菌的機(jī)制，目前所知甚少。Lajarin等［13］發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌能在肝細(xì)胞內(nèi)生長，采用 TNF－α、IL－lβ和 LPS聯(lián)合刺激后，肝細(xì)胞中鼠傷寒沙門菌的生長能力下降。Mellouk等［14］報(bào)道IFN－α刺激可以增加肝細(xì)胞活性氮（NO）的濃度，從而抑制肝細(xì)胞內(nèi)惡性瘧原蟲的生長。在以血管內(nèi)皮為模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，Assis等［15］發(fā)現(xiàn)采用TNF－α和IFN－α刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，進(jìn)入細(xì)胞的銅綠假單胞菌生長能力顯著下降。

細(xì)胞因子對尿路上皮細(xì)胞抗菌功能的影響還未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本文研究中，我們比較系統(tǒng)的觀察了TNF－α、IL－lβ等細(xì)胞因子對進(jìn)入膀胱上皮細(xì)胞的肺炎克雷伯桿菌生存的影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用TNF－α能夠不同程度的促進(jìn)膀胱上皮細(xì)胞抗菌活性，聯(lián)合使用TNF－α與IFN－γ能更加顯著地促進(jìn)T24細(xì)胞的抗菌作用。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用過氧化氫酶（CATA），顯著抑制T24細(xì)胞抗菌活性，表明上皮細(xì)胞抗菌過程中H2O2起著重要的作用。L－NAME是一氧化氮合酶的抑制劑，本研究顯示LNAME對T24細(xì)胞抗菌活性無明顯影響，因此NO可能不涉及膀胱上皮細(xì)胞抗菌作用。

與吞噬細(xì)胞相似，上皮細(xì)胞也可以表達(dá)抗菌活性多肽或者蛋白（如β－防御素），但是這些分子是否參與對抗胞內(nèi)細(xì)菌缺乏細(xì)胞或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證據(jù)。一般認(rèn)為上皮細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌肽分泌到粘膜表面形成抗菌生化屏障。IL－lβ可以顯著刺激上皮細(xì)胞表達(dá)抗菌肽，本研究發(fā)現(xiàn)IL－lβ并不能顯著增強(qiáng)T24細(xì)胞抗菌功能，提示抗菌活性多肽或蛋白與T24細(xì)胞對抗胞內(nèi)肺炎克雷伯桿菌無關(guān)。上皮細(xì)胞清除胞內(nèi)細(xì)菌是極為復(fù)雜的生物學(xué)過程，這中間涉及了細(xì)菌對上皮細(xì)胞粘附，上皮細(xì)胞吞噬（攝取）細(xì)菌，上皮細(xì)胞天然免疫受體對細(xì)菌的識別，細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)及信號傳遞，功能基因的表達(dá)等，值得我們深入探討。

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