張吉鹍，張震宇，吳文旋，李龍瑞，鄒慶華

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.江西新天地藥業(yè)有限公司獸藥研究院，江西 峽江 331400)

山羊飼喂稻草基礎(chǔ)日糧并補(bǔ)飼適量的苜蓿，由于飼料間的組合效應(yīng)，提高了稻草在瘤胃的發(fā)酵率、消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量與微生物蛋白的合成效率以及山羊氮的沉積率。但當(dāng)?shù)静莼A(chǔ)日糧補(bǔ)飼的苜蓿超過50%，由于可發(fā)酵有機(jī)物的不足而發(fā)生能氮不配對發(fā)酵，使得補(bǔ)飼苜蓿對提高稻草基礎(chǔ)日糧氮利用效率的組合效應(yīng)降低[1–2]。譚支良[3]研究了綿羊日糧中結(jié)構(gòu)性碳水化合物(SC)與非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)的比例、過瘤胃蛋白(UDP)與瘤胃降解蛋白(RDP)比例及其相互作用對瘤胃動(dòng)力學(xué)及日糧營養(yǎng)物質(zhì)在十二指腸的流通量，但未就十二指腸氨基酸的流量進(jìn)行研究。卜登攀[4]的研究證明，提高日糧的能氮同步性，可增加瘤胃的液相流通速率，促進(jìn)瘤胃微生物的合成，提高十二指腸食糜氨基酸的流量。筆者在研究山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿對消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量影響[2]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究苜蓿補(bǔ)飼水平對瘤胃動(dòng)力學(xué)參數(shù)、十二指腸氨基酸流量的影響，旨在從十二指腸氨基酸流量與氨基酸組成模式進(jìn)一步探討山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼苜蓿增加瘤胃微生物氮利用效率的組合效應(yīng)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選9 只體況良好，體重相近((41.3±1.2) kg)，安裝有永久性瘤胃瘺管、十二指腸瘺管、回腸瘺管的成都麻羊半同胞羯羊進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期體外批次發(fā)酵的組合效應(yīng)研究結(jié)果[5]，決定在山羊稻草基礎(chǔ)日糧中分別補(bǔ)飼25%、50%與75%的苜蓿，即將稻草與苜蓿干草(MSL)分別以75∶25(MSL25)、50∶50 (MSL50)與25∶75(MSL75) 的比例組成3 個(gè)混合粗飼料，并制成草塊。

試驗(yàn)采用單因子3 處理重復(fù)設(shè)計(jì)，按體重相似和隨機(jī)方法將試驗(yàn)羊只分成3 組，每組3 只，分別飼以3 組混合粗飼料，以探討山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿(25%、50%與75%)對山羊瘤胃動(dòng)力學(xué)參數(shù)、十二指腸氨基酸流量的影響。

試驗(yàn)羊單籠飼養(yǎng)，預(yù)試期14 d，正試期7 d，每日于6：00 和18：00 飼喂，自由飲水，常規(guī)光照、驅(qū)蟲與管理。

1.3 消化道食糜流通量測定

1.3.1 標(biāo)記物制備

選用Co–EDTA 為食糜標(biāo)記物，根據(jù)Uden 等[7]的方法制備：稱取25 g 乙酸鈷、29.2 g 乙二胺四乙酸和4.0 g 氫氧化鈉放入2 L 燒杯中，加入200 mL蒸餾水，加熱至80 ℃溶解，冷卻后再加入20 mL 30%過氧化氫溶液，室溫放置4 h 后，加入300 mL 體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，置于冰箱12 h 后，經(jīng)定性濾紙過濾并用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液沖洗數(shù)遍。收集濾紙上粉紅色物質(zhì)于瓷盤中，置于100 ℃烘箱中烘干即可。實(shí)測該Co–EDTA 標(biāo)記物Co 含量為14.08%。

1.3.2 灌注液配制

啟動(dòng)灌注液配制：稱取Co–EDTA 3.6 g 定容至1 200 mL，質(zhì)量濃度約為4.20×10–4g/L。

連續(xù)灌注液配制：稱取Co–EDTA 20 g 定容至70 L，質(zhì)量濃度約為4.0×10–5g/L 。

1.3.3 標(biāo)記物的灌注及采樣

預(yù)試期結(jié)束后，在正試期的第1 天早晨8:00 開始啟動(dòng)灌注。將100 mL 啟動(dòng)灌注液通過注射器經(jīng)采樣管迅速注入瘤胃內(nèi)不同位點(diǎn)。灌注完畢后，用采樣管盡量充分?jǐn)噭蛄鑫敢海⒊槿×鑫敢悍磸?fù)沖洗采樣管和注射器，沖洗瘤胃液應(yīng)及時(shí)灌回瘤胃內(nèi)，緊接著進(jìn)行連續(xù)灌注。連續(xù)灌注采用一次性輸液器進(jìn)行，調(diào)整流速約為1.40 mL/min，每天灌注連續(xù)灌注液2 000 mL，連續(xù)灌注7 d。從連續(xù)灌注的第5 天開始，采集瘤胃、十二指腸食糜樣本。采集方法是拔掉瘺管塞，使食糜自動(dòng)流出，并收集于塑料采樣瓶內(nèi)。每日采樣4 次，連續(xù)采集3 d。每日采樣時(shí)間交替變化，每隔6 h 采集瘤胃食糜50 mL，十二指腸食糜15 mL。采樣時(shí)間點(diǎn)，第1 天：01：00、07：00、13：00、19：00；第2 天：03：00、09：00、15：00、21：00；第3 天：05：00、11：00、17：00、23：00。

將3 d 內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采集的瘤胃、十二指腸食糜等量混合制成混合樣本，冷凍干燥，以備測其中的干物質(zhì)(DM)、總氮、Co 濃度和氨基酸等成分。

1.4 測定方法

1.4.1 混合樣本干物質(zhì)(DM)的測定

按照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。

1.4.2 Co 的測定

瘤胃液相Co 的測定：取10 mL 瘤胃液于4 000 r/min 離心10 min，取上清液直接上機(jī)測定。食糜Co 濃度測定：稱取食糜樣品約0.5 g，放入25 mL坩堝中，置于馬福爐內(nèi)，在400 ℃下灼燒2 h，冷卻后加入3 mol/L HNO3和3mol/L HCl 溶解所得灰分，過濾，將濾液定容至25 mL。取濾液，用原子吸收光譜儀進(jìn)行Co 的測定。

1.4.3 十二指腸食糜微生物蛋白質(zhì)測定

采用Zinn 等[9]建立的嘌呤法測定。

1.4.4 氨基酸測定

將食糜凍干樣在6 mol/L HCl 下水解22 h 后，減壓蒸干，用0.02 mol/L HCl 重新溶解定容后，用日立835 型氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

1.5 計(jì)算方法

1.5.1 食糜流通量的計(jì)算

先擬合出瘤胃食糜標(biāo)記物中鈷濃度(Ct)與時(shí)間(t)的遞降曲線Ct=C0×e–kt，計(jì)算出停止灌注標(biāo)記物時(shí)瘤胃食糜中初始標(biāo)記物濃度C0和瘤胃食糜流通速率常數(shù)Kp 值(即曲線的K 值，也就是瘤胃液相小數(shù)稀釋率)，按下列公式進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算。 瘤胃液相食糜流通速率F(L/h)，

十二指腸食糜流通量QD(g/d)，

1.5.2 瘤胃液相體積

瘤胃液相體積V(L)，

1.5.3 食糜內(nèi)養(yǎng)分流通速率

食糜內(nèi)養(yǎng)分流通速率(mg/h)=食糜內(nèi)養(yǎng)分濃度×食糜流通速率。

1.5.4 微生物氮(MN)流通量

微生物氮(MN)流通量(QMN)(g/d)

1.5.5 氨基酸流通量

氨基酸流通量(DFAAi)(g/d)，

DFAAi=CDAAi×QD

式中：DFAAi 為十二指腸食糜中第i 種氨基酸流通量；CDAAi 為第i 種氨基酸含量；QD為十二指腸食糜流通量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SAS(6.12)軟件的一般線性模型(GLM)程序進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻草補(bǔ)飼苜蓿對山羊瘤胃動(dòng)力學(xué)及微生物蛋白合成的影響

稻草補(bǔ)飼不同水平苜蓿后，山羊瘤胃液相小數(shù)稀釋率、瘤胃液相外流速率、瘤胃液相體積、瘤胃液相MCP 庫容量、MCP 流通速率及MCP 流通量見表1。由表1 可知，稻草補(bǔ)飼苜蓿對瘤胃液相小數(shù)稀釋速率影響不顯著(P＞0.05)，但對液相外流速率、瘤胃液相體積及微生物蛋白質(zhì)合成的影響在一些組間差異顯著(P＜0.05)。3 個(gè)試驗(yàn)組瘤胃小數(shù)稀釋速率基本接近。瘤胃液相外流速率、MCP 流通速率均以MSL50 最高，MSL75 與之接近，MSL25 最低，與MSL50、MSL75 的相應(yīng)值差異均顯著(P＜0.05)。瘤胃液相體積亦以MSL50 的最高，要顯著高于MSL75 與MSL25 的(P＜0.05)，其中MSL75與MSL25 的組間差異不顯著(P＞0.05)。瘤胃液相MCP 庫(細(xì)菌氮合成–流出后的凈平衡值)容量隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加而增加，但MSL50 與MSL25、MSL75 的差異不顯著(P＞0.05)，其余組間差異顯著(P＜0.05)。MCP 流通量亦隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加而增加，其自高到低的排序?yàn)镸SL75、MSL50、MSL25，其中MSL75 與MSL50 的組間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿的瘤胃動(dòng)力學(xué)參數(shù)及微生物蛋白質(zhì)流通量

2.2 稻草補(bǔ)飼苜蓿對山羊十二指腸含氮物質(zhì)流通量的影響

稻草補(bǔ)飼不同水平苜蓿，山羊十二指腸含氮物質(zhì)流通量見表2。由表2 可知，MSL25、MSL50 與MSL75 的十二指腸微生物氮流量、十二指腸非微生物氮流量均隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加而增加，差異顯著(P＜0.05)。微生物氮占總氮的百分比(MN/TN)亦隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加而增加，但MSL50 與MSL25、MSL75 的差異不顯著(P＞0.05)，其余組間差異顯著(P＜0.05)。MSL50 的微生物氮流量較MSL25 提高6.27%，MSL75 較MSL50、MSL25 則分別提高4.04%與10.56%，而MSL50 的MSL 補(bǔ)飼量是MSL25 的2 倍，MSL75 的MSL 補(bǔ)飼量則分別為MSL50、MSL25 的1.5 倍與3 倍，表明稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼苜蓿的山羊十二指腸微生物氮流量隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加呈降低的趨勢，當(dāng)超過50%時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)。十二指腸非微生物氮流量、十二指腸微生物氮流量占總氮流量的百分比亦呈現(xiàn)類似的變化。

表2 山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿的十二指腸含氮物質(zhì)流通量

2.3 稻草補(bǔ)飼苜蓿對進(jìn)入十二指腸食糜內(nèi)氨基酸流量的影響

稻草補(bǔ)飼不同水平苜蓿對山羊十二指腸食糜內(nèi)必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)流量的影響見表3、表4。由表3、表4 可知，稻草補(bǔ)飼不同水平苜蓿對進(jìn)入十二指腸食糜內(nèi)各種氨基酸、總必需氨基酸(TEAA)、總非必需氨基酸(TNEAA)以及總氨基酸(TAA)均有顯著影響(P＜0.05)。除個(gè)別氨基酸及總必需氨基酸外，總的趨勢是補(bǔ)飼苜蓿水平越高，氨基酸的流量越高，差異顯著(P＜0.05)。除苜蓿蛋白含有較高的EAA[9–10]外，亦與補(bǔ)飼MSL增加了瘤胃細(xì)菌蛋白質(zhì)產(chǎn)量有關(guān)[1]。細(xì)菌蛋白質(zhì)富含Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 等氨基酸[11–12]，本試驗(yàn)中Arg、Leu、Lys、Ile、Thr、Gly、Glu 和Ala 流量均受MSL 補(bǔ)飼的影響，這是因?yàn)檠a(bǔ)飼苜蓿提高了微生物氮流量，因此這幾種氨基酸流量的增加可能主要與進(jìn)入十二指腸的瘤胃細(xì)菌蛋白質(zhì)合成量提高有關(guān)。由于十二指腸內(nèi)氨基酸的流量不僅來自日糧的過瘤胃蛋白(UDP)和瘤胃MCP，同時(shí)也有內(nèi)源氨基酸的貢獻(xiàn)，如脫落的細(xì)胞及細(xì)胞分泌等，故有關(guān)苜蓿補(bǔ)飼對進(jìn)入小腸的氨基酸數(shù)量與平衡方面的研究還有待進(jìn)一步深入。

表3 山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿的十二指腸食糜必須氨基酸流量 g/d

表4 山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿的十二指腸食糜非必須氨基酸流量 g/d

3 討 論

a.適量補(bǔ)飼苜蓿，可增加山羊瘤胃微生物蛋白流量。液相流通速率是水、可溶性飼料成分和被微生物降解的可溶性養(yǎng)分的流通速率。含氮物質(zhì)和能量載體物質(zhì)在瘤胃降解及二者被微生物整合利用狀況，除與微生物對其分解程度有關(guān)外，還與流通速率有關(guān)。流通速率快時(shí)，微生物周轉(zhuǎn)加快，對飼料的降解率降低，過瘤胃比例提高。由于流通速率的增加，日糧同步性高而流通速率快，則可減少瘤胃內(nèi)能量和氮素的再循環(huán)，減少微生物細(xì)胞自溶和維持需要，從而能增加進(jìn)入小腸的MCP 流量[4]。本研究MCP 流通量隨MSL 補(bǔ)飼水平的增加而非線性增加，且MSL75 與MSL50 的組間差異不顯著，表明山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼苜蓿，可以改善日糧的能氮平衡，增加MCP 的合成量，同時(shí)還表明，補(bǔ)飼苜蓿要適度，超過這個(gè)“度”(本研究為50%)，改善日糧能氮平衡、增加MCP 產(chǎn)量的組合效應(yīng)不明顯。 b.適量補(bǔ)飼苜蓿，可增加山羊十二指腸氨基酸流量 。本研究3 組混合粗飼料的十二指腸微生物氮流量為3.03～3.35 g/d，平均為3.20 g/d，這在其他學(xué)者報(bào)道的范圍之內(nèi)[4，13–14]。瘤胃每天MCP 總產(chǎn)量與瘤胃可利用能密切相關(guān)[15–16]，反芻動(dòng)物秸稈基礎(chǔ)飼料補(bǔ)飼苜?？梢源龠M(jìn)纖維分解菌的生長，從而提高秸稈的消化率[17]，增加了稻草中的可發(fā)酵物質(zhì)，使得能氮更趨平衡，從而增加了瘤胃MCP 的產(chǎn)量，也就增加了進(jìn)入十二指腸微生物蛋白的流量，進(jìn)而增加了十二指腸的氨基酸流量，但這種增加并非隨稻草基礎(chǔ)日糧中苜蓿的增加而線性增加，當(dāng)MSL 補(bǔ)飼量超過50%時(shí)，總必需氨基酸流量的增加不顯著，一些氨基酸的流量甚至減少。表明繼續(xù)增加MSL 補(bǔ)飼量，由于可發(fā)酵有機(jī)物的不足會(huì)導(dǎo)致能氮不平衡而減少十二指腸氨基酸流量的增幅，造成優(yōu)質(zhì)干草苜蓿的浪費(fèi)。

[1]張吉鹍，李龍瑞，吳文旋，等．稻草補(bǔ)飼苜蓿對山羊部分血液生化指標(biāo)及氮代謝的影響研究[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5)：待發(fā)表．

[2]張吉鹍，張震宇，吳文旋，等．山羊稻草基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼不同水平苜蓿對消化道各部位營養(yǎng)物質(zhì)流通量的影響研究[J]．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(6)：待發(fā)表．

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