趙海濱，張秀靜，王 帥，郭 夢(mèng)，馬 迪，許曉英

急性心肌梗死（AMI）后的心肌重塑與心臟破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥密切相關(guān)，在AMI病死率及預(yù)后中起至關(guān)重要的作用[1]。AMI后心肌重塑機(jī)制復(fù)雜，后果嚴(yán)重，療效不理想，相關(guān)研究亟待深入。目前研究證實(shí)[2]，在AMI時(shí)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可自發(fā)地向損傷心肌歸巢，并在梗死部位特定的微環(huán)境誘導(dǎo)作用下，分化成新的心肌細(xì)胞，達(dá)到修復(fù)和再生心肌的目的，且能與宿主細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)“無(wú)創(chuàng)性”組織再生，抑制/減緩心肌重塑的發(fā)生。但目前對(duì)其歸巢缺乏有效的動(dòng)員手段。活血化瘀中藥以中醫(yī)“祛瘀血、生新血”為理論基礎(chǔ)，對(duì)AMI后心肌重塑療效肯定，本課題組通過(guò)研究祛瘀生新法在大鼠急性心梗后心肌重塑中的干預(yù)作用及對(duì)BMSCs“歸巢”動(dòng)員的影響，探討祛瘀生新法對(duì)急性心梗后心肌重塑的效應(yīng)機(jī)制，為活血化瘀藥治療急性心梗后心肌重塑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 成年清潔級(jí)Wistar大鼠80只，體質(zhì)量（250±10）g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證號(hào)0240574）；試劑用藥血塞通軟膠囊由昆明圣火制藥有限責(zé)任公司提供（批號(hào)Z19990022），基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1受體阻斷劑（AMD3100）由北京啟維益成科技有限公司提供（批號(hào)239820-5MG），熒光素藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞抗原1抗體及心肌c-kit抗體均由北京博奧森生物科技有限公司提供；多媒體生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)MS2000型（廣州市龍飛科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組，每組16只，分籠飼養(yǎng)。

模型組：參照文獻(xiàn)[3－4]制備AMI大鼠模型。鹽酸戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。經(jīng)口氣管插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量 5～6 mL，呼吸比 1∶2，呼吸頻率 80 次/min。連接標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)，記錄大鼠心電圖。經(jīng)左前胸廓旁第3、4肋間逐層開胸，暴露心臟，分離心包，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界處用5-0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）近端制成心肌梗死模型，以心電圖出現(xiàn)壞死性Q波判斷為可能心肌梗死，若無(wú)病理性Q波，則再次結(jié)扎，以提高心肌梗死模型成功率，然后逐層縫合心腔。術(shù)后常規(guī)抗感染治療。

中藥組：制備AMI大鼠模型，術(shù)后立即灌胃給藥，給藥量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》所示劑量換算法計(jì)算[5]：200g大鼠劑量（g/kg）=成人的劑量[1g/（kg·d）×0.018]。每日灌胃 1 次，共用 7 d。

西藥組：制備AMI大鼠模型,第6天腹腔注射AMD3100（5 mg/kg），余同模型組大鼠。

假手術(shù)組：大鼠經(jīng)歷上述手術(shù)過(guò)程，絲線從冠狀動(dòng)脈下穿過(guò)但不結(jié)扎。

正常組：不做造模處理。

1.2.2 病理形態(tài)學(xué)檢查 于上述各組處死大鼠，取心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片蘇木-伊紅（H-E）染色。常規(guī)H-E染色在光鏡下進(jìn)行病理觀察。

1.2.3 心肌梗死面積硝基四氮唑藍(lán)（N-BT）染色 參照Shatney等[6]的N-BT組化染色方法造模1周后，處死動(dòng)物，取出心臟，以結(jié)扎線為標(biāo)志，每隔3 mm取心臟橫斷面，每只大鼠心臟取材3塊，生理鹽水沖洗，N-BT染色后，微距照相，像片輸入圖像處理系統(tǒng)，每只大鼠心臟取5個(gè)橫斷面，分別記錄梗死區(qū)占心臟橫截面的面積百分比，取其平均值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，肝素抗凝。Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，稀釋至1×106個(gè)/mL，分別加入PE標(biāo)記的c-kit受體單克隆抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) 采用S-P法，DAB顯色，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，每張切片隨機(jī)取9個(gè)視野，取其均值作為測(cè)定值，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理學(xué)觀察 H-E染色結(jié)果顯示：正常組及假手術(shù)組整體均呈現(xiàn)正常心肌膜組織（見圖1A、圖1B）。模型組：心肌細(xì)胞數(shù)量較少且散在，結(jié)締組織整片廣布，炎性細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞多，整體呈現(xiàn)心肌梗死（重癥）心肌膜組織（見圖1C）。中藥組：心肌細(xì)胞間有大量炎性細(xì)胞聚集，整體呈現(xiàn)心肌炎心肌膜組織（見圖1D）。西藥組：結(jié)締組織整片占據(jù)切片較大區(qū)域，炎性細(xì)胞散在，淺粉紅色膠原成分較多，紅細(xì)胞聚集且多，整體呈現(xiàn)心肌梗死（輕癥）心肌膜組織（見圖1E）。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果 模型組、中藥組、西藥組均高于假手術(shù)組（P<0.01），中藥組與西藥組均低于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無(wú)明顯差異（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n 心肌梗死面積（%）假手術(shù)組 10 2.60±1.67模型組 10 21.18±2.29*中藥組 10 16.40±3.11*#西藥組 10 15.23±2.12*#△

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 模型組、中藥組、西藥組均高于假手術(shù)組（P<0.01），中藥組與西藥組均高于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無(wú)明顯差異（P>0.05）。見表2。

表2 各組外周血PE標(biāo)記CD117細(xì)胞數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組外周血PE標(biāo)記CD117細(xì)胞數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n CD117細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組 10 1.60±0.67*模型組 10 2.18±0.29*中藥組 10 3.40±0.11*#西藥組 10 4.23±0.12*#△

2.4 免疫組化檢測(cè) 見圖2。模型組、中藥組、西藥組均高于假手術(shù)組（P<0.01），中藥組與西藥組均高于模型組（P<0.05），中藥組與西藥組無(wú)明顯差異（P>0.05），見表3。

圖1 各組心肌組織病理圖像（H-E染色×200）

圖2 各組心肌組織免疫組化檢測(cè)圖像（×400）

表3 各組免疫組化c-kit標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 各組免疫組化c-kit標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05；與中藥組比較，△P>0.05。

組別 n c-kit標(biāo)記細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組 10 26.0±6.7模型組 10 168.0±7.5*中藥組 10 188.0±7.9*#西藥組 10 195.0±6.8*#△

2.5 非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定 結(jié)果顯示：模型組與假手術(shù)組相比較，非梗死區(qū)膠原沉積明顯（P＜0.05），活血化瘀組與模型組相比較膠原沉積降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定結(jié)果（±s）

表4 各組非梗死區(qū)膠原蛋白測(cè)定結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與活血化瘀組比較，△P>0.05。

組別 n 膠原蛋白含量（%）假手術(shù)組 10 3.42±0.47模型組 10 6.03±0.54*活血化瘀組 10 5.10±0.36#AMD3100 組 10 5.06±0.27#△

3 討論

BMSCs是一種來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞，BMSCs不僅可向多種組織細(xì)胞分化，表現(xiàn)出很強(qiáng)的可塑性，而且還存在廣泛遷移現(xiàn)象，即“干細(xì)胞循環(huán)”，指干細(xì)胞通過(guò)機(jī)體的調(diào)控不斷地由原組織位點(diǎn)向新的組織位點(diǎn)遷移，并不斷進(jìn)行自我更新和分化的過(guò)程，在生理或病理情況下參與多種組織的更新和修復(fù)，維持機(jī)體組織形態(tài)完整性和功能穩(wěn)定性[7]。最近研究表明[8－9]，BMSCs“歸巢”在AMI后心肌重塑保護(hù)效應(yīng)中療效確切，因而也應(yīng)是較佳的治療靶點(diǎn)，然而正常情況下外周血中干細(xì)胞含量很低，達(dá)不到修復(fù)壞死心肌所需的濃度。西醫(yī)學(xué)治療AMI后心肌重塑，主要使用粒細(xì)胞集落刺激因子、AMD3100、粒巨細(xì)胞集落刺激因子等作為心肌梗死后干細(xì)胞“歸巢”的有效動(dòng)員劑。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)心梗后，外周血及梗死心肌區(qū)BMSCs明顯增多，可能和ADM3100對(duì)干細(xì)胞循環(huán)有動(dòng)員效應(yīng)。

心肌梗死屬中醫(yī)“胸痹、真心痛”的范籌，是血道閉塞，血脈不通，瘀血滯塞脈絡(luò)所致，以“血?dú)獠恢痢薄ⅰ把涣鳌?、“血瘀滯不行”等為主要病理機(jī)制，以胸悶胸痛、心悸氣短等為主要癥狀?！办铕錾隆币喾Q化舊生新、除舊生新，一方面通過(guò)祛瘀、化舊、或去腐等方法來(lái)祛除體內(nèi)沉積的瘀血及其他陳舊性的病理產(chǎn)物，另一方面強(qiáng)調(diào)應(yīng)用生新方法來(lái)生新血、生新絡(luò)、生新物，“祛瘀”與“生新”相輔相成，不可偏廢[10]，因此王清任推崇逐瘀活血[11]。范英昌等[12]證實(shí)活血化瘀丹參提取物能增加心肌梗死區(qū)的血供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)活血化瘀藥對(duì)大鼠急性心梗后心肌重塑的作用干預(yù)后，藥物組較模型組膠原含量明顯降低（P＜0.05），心肌梗死面積也有所減輕，這可能與活血化瘀中藥?kù)铕鐾ńj(luò)有關(guān)，也證實(shí)了活血化瘀藥能減輕大鼠心肌梗死面積。流式細(xì)胞儀及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥組較模型組BMSCs均明顯增多，說(shuō)明活血化瘀藥能改善大鼠心肌梗死區(qū)的BMSCs數(shù)量，也是“生新血”的具體體現(xiàn)。至于活血化瘀法對(duì)提高大鼠心肌梗死區(qū)BMSCs數(shù)量的活化調(diào)控機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入研究。

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