冼燕萍，陳立偉，羅海英，郭新東，吳玉鑾，羅東輝，侯向昶

(廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣州) 廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣東 廣州 510110)

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)屬于糖肽類抗生素，常用于治療細(xì)菌感染。農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告規(guī)定萬(wàn)古霉素為禁用獸藥［1］，如果這類藥物被違規(guī)濫用于動(dòng)物的養(yǎng)殖，很可能因其耐藥性問(wèn)題而影響動(dòng)物性食品的安全、公共衛(wèi)生以及出口貿(mào)易，長(zhǎng)期食用則有可能導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生更嚴(yán)重的抗生素耐藥性。萬(wàn)古霉素被列入衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第1－5批匯總)》，并注明“需要研制動(dòng)物性食品中測(cè)定萬(wàn)古霉素的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法”［2］。因此，開(kāi)展動(dòng)物性食品中萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素殘留量的檢測(cè)技術(shù)研究迫在眉睫。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于萬(wàn)古霉素等糖肽類抗生素［3－14］的檢測(cè)方法有高效液相色譜法［5－8］、高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［9－14］，但檢測(cè)對(duì)象多為血液樣品［5－8］，而關(guān)于食品中萬(wàn)古霉素的分析方法報(bào)道較少。劉佳佳等［10］采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)了牛奶中萬(wàn)古霉素的含量。本文建立了豬肉中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)，可為政府進(jìn)一步打擊違法添加非食用物質(zhì)和推動(dòng)食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系的完善提供技術(shù)支持。

圖1 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of vancomycin and norvancomycin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTMTQ MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);高速離心機(jī)5804R(德國(guó)Eppendorf公司);T18均質(zhì)器、MS3 Basic漩渦混合器(德國(guó)IKA公司);KQ－250DV型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);N－EVAP 112水浴氮吹儀(美國(guó)OA公司);Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司);固相萃取裝置(美國(guó)Waters公司);LC－C18固相萃取小柱(CNW公司，200 mg/3 mL):臨用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，3 mL 0.1%甲酸水－乙腈(9∶1，體積比)平衡。

萬(wàn)古霉素(含量95%，Sigma公司);去甲萬(wàn)古霉素(含量83.4%，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇和乙腈(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)，甲酸(HPLC級(jí)，CNW公司)，正己烷(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)，超純水(18.2 MΩ)。10例豬肉樣品均購(gòu)于本地市場(chǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%甲酸水溶液配成100 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存。

根據(jù)需要，用經(jīng)前處理所得的陰性樣品基質(zhì)溶液配成不同濃度的系列基質(zhì)匹配混合校準(zhǔn)工作液，當(dāng)天配制。以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取 稱取已均質(zhì)的試樣5.0 g(精確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中，加入5 mL 0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)，渦漩3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液于10 mL比色管中，重復(fù)提取1次，合并上清液，定容至10 mL。取5 mL提取液于15 mL塑料離心管中，加入5 mL正己烷(乙腈飽和)，渦漩2 min，12 000 r/min離心3 min，棄去正己烷層，重復(fù)用正己烷脫脂1次，下層提取液待凈化。

1.3.2 凈 化 吸取2.0 mL待凈化液于試管中，加入4.0 mL 0.1%甲酸水，混勻，加入已活化的LC－C18固相萃取小柱中，控制流速不大于1 mL/min，待液體全部流出后，分別用2 mL 0.1%甲酸水－乙腈(9∶1)溶液和1 mL 50%甲醇潤(rùn)洗試管，轉(zhuǎn)入小柱，棄去淋洗液，然后用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用0.1%甲酸水－乙腈(9∶1)溶解，轉(zhuǎn)移、定容至1.0 mL，樣液過(guò)0.22 μm濾膜后，供UPLC－MS/MS分析。

1.4 UPLC－MS/MS檢測(cè)條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫程序:0.0～0.5 min，95%A;0.5～1.5 min，95%～85%A;1.5～3.0 min，85%～75%A;3.0～3.1 min，75%～95%A;3.1～5.0 min，95%A;流速:0.25 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5 μL。

質(zhì)譜條件:ESI正模式;毛細(xì)管電壓1.0 kV;離子源溫度150℃;去溶劑氣溫度500℃;去溶劑氣:氮?dú)猓魉?00 L/h;錐孔氣:氮?dú)?，流?0 L/h;碰撞氣:高純氬氣，流速0.2 mL/min;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;2種化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)、豐度比及其它優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)(錐孔電壓、碰撞能等)見(jiàn)表1，每個(gè)離子對(duì)的駐留時(shí)間均為0.1 s。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析條件Table 1 MS parameters for the analysis of vancomycin and norvancomycin

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素均含有一個(gè)二氯三苯基醚結(jié)構(gòu)單元、兩個(gè)糖基和多個(gè)氨基酸，去甲萬(wàn)古霉素比萬(wàn)古霉素少1個(gè)甲基，兩者的分子量分別為1 449和1 435。在一級(jí)質(zhì)譜中，易與H+結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的雙電荷離子［M+H］2+，質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)m/z 725.6和m/z 718.1，以此作為萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的母離子，并優(yōu)化錐孔電壓，使母離子強(qiáng)度最大。帶多電荷的母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后，發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的碎片離子，優(yōu)化碰撞電壓，使每種化合物的主要特征碎片離子的強(qiáng)度達(dá)到最大，并以豐度最大的兩個(gè)碎片離子作為定性與定量離子。2種目標(biāo)物的子離子掃描質(zhì)譜圖如圖2所示，特征離子對(duì)和電離條件、碰撞條件見(jiàn)表1。

圖2 萬(wàn)古霉素(A)和去甲萬(wàn)古霉素(B)的子離子掃描圖Fig.2 Daughter scan spectra of vancomycin(A)and norvancomycin(B)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在流動(dòng)相中加入甲酸，可以為目標(biāo)化合物提供必需的質(zhì)子來(lái)源，提高離子化效率。用等度洗脫或梯度洗脫變化太快時(shí)，由于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)僅相差1個(gè)甲基，二者不能完全分離。采用“1.4”所示的梯度洗脫，可將2種目標(biāo)物分離，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間分別為2.72 min和2.64 min，目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 μg/L)的總離子流圖(TIC)和提取離子色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 μg/L)的總離子流圖(A)和提取離子色譜圖(B～C)Fig.3 Total ion chromatogram(A)and selective ion chromatograms of norvancomycin(B)and vancomycin(C)mixture standard(5.0 μg/L)

2.3 前處理?xiàng)l件的確定

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素均為兩性化合物且結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，故易溶于水，微溶于甲醇等有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)在陰性豬肉樣品中添加10 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)比了以甲醇、乙腈、水、0.1%甲酸水、0.1%甲酸水－乙腈(1∶1)作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，以純有機(jī)溶劑提取時(shí)，提取液澄清，但因溶解度問(wèn)題，回收率偏低;以純水相提取時(shí)，提取液渾濁，難以離心分離或過(guò)濾膜，造成后續(xù)凈化困難;以0.1%甲酸水－乙腈(1∶1)提取時(shí)，提取液較澄清，回收率較高，但提取液中2種化合物的響應(yīng)值比純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值高，計(jì)算得到的回收率均超過(guò)100%，說(shuō)明存在基質(zhì)效應(yīng)。因此，本文在進(jìn)一步比較不同體積比0.1%甲酸水－乙腈混合體系的提取效果時(shí)，均與相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，回收率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，0.1%甲酸水的體積分?jǐn)?shù)為50%、60%和70%時(shí)，提取效果較好。

圖4 不同配比提取溶劑的提取回收率Fig.4 Comparison of recoveries of extraction solution with different proportions

本文先采用正己烷除去提取液中的脂肪類等非極性雜質(zhì)。由于動(dòng)物肌肉組織基質(zhì)比較復(fù)雜，提取液中還含有其它的共萃取雜質(zhì)干擾檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)儀器產(chǎn)生一定的污染，因此需進(jìn)一步凈化處理。根據(jù)目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，對(duì)比了ENVI－Carb(Supelclean，500 mg/6 mL)、Strata － x(Phenomenex，200 mg/3 mL)和LC－C18(CNW，200 mg/3 mL)3種反相固相萃取小柱的凈化效果。根據(jù)圖4，提取效果較好的提取溶劑體系至少含有30%乙腈，此時(shí)若直接上樣，待測(cè)物會(huì)直接從反相固相萃取小柱上流出。因此，比較了上樣溶液中乙腈含量分別為0%、5%、10%、20%和30%的情況，分別以上述5種配比的0.1%甲酸水－乙腈混合溶液配制10 μg/L待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取2 mL加入3種預(yù)先用甲醇、水活化的固相萃取小柱中，以2 mL對(duì)應(yīng)比例的甲酸水－乙腈溶液淋洗后再以1 mL 50%甲醇淋洗，8 mL甲醇洗脫，收集各個(gè)步驟的流出液進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率(結(jié)果見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明上樣溶液中乙腈的比例不高于10%時(shí)，LC－C18小柱的回收率最好(92%～101%)。

圖5 3種固相萃取小柱和不同配比加樣溶液的回收率Fig.5 Comparison of recoveries of different SPE and sample solution

綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)作為提取溶劑，然后取2.0 mL提取液加入4.0 mL 0.1%甲酸水，將乙腈的比例釋釋至10%，再用LC－C18小柱凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系與檢出限

采用LC－MS/MS檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)，常出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，影響定量分析的準(zhǔn)確度和精密度［15］。Matusewski等［16］建立了基質(zhì)效應(yīng)的確認(rèn)方法，即比較陰性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的差異:當(dāng)比值等于或接近1時(shí)，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響;大于1時(shí)，表明存在離子增強(qiáng)作用，反之則表明存在離子抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)配制濃度范圍為0～50 μg/L的系列基質(zhì)匹配校準(zhǔn)工作溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算基質(zhì)校準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來(lái)考察方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):萬(wàn)古霉素的斜率比值為2.36，去甲萬(wàn)古霉素的斜率比值為1.85，說(shuō)明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中雖嘗試采用改善樣品前處理［17］以及色譜或質(zhì)譜條件［18］等手段來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)，但未獲得明顯效果，因此采用陰性基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2種待測(cè)物在陰性豬肉基質(zhì)中的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素在1～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99;檢出限(LOD，S/N=3)分別為0.5 μg/kg和0.3 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為2.0 μg/kg和1.0 μg/kg，表明方法具有較高的靈敏度。

表2 豬肉中2種目標(biāo)物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 2 analytes in pork

圖6 不同樣品的TIC色譜圖(A～C)及提取離子色譜圖(D～E)Fig.6 Total ion chromatograms of different samples(A－C)and selective ion chromatograms(D－E)

2.5 方法的回收率與精密度

選取陰性豬肉樣品，按本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行3個(gè)加標(biāo)水平(LOQ、2LOQ、10LOQ)的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用中間濃度的加標(biāo)水平連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。2種目標(biāo)物的平均回收率為80%～88%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于13.4%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于12.5%，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的TIC圖、陰性豬肉樣品的TIC圖、添加水平為L(zhǎng)OQ的陰性豬肉樣品的TIC圖及其提取離子色譜圖見(jiàn)圖6。

表3 豬肉的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of 2 analytes in pork

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法測(cè)定了本地市場(chǎng)銷售的10例豬肉樣品，均未檢出2種目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)測(cè)定豬肉中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的方法，以0.1%甲酸水－乙腈(7∶3)混合體系協(xié)同提取，正己烷(乙腈飽和)和LC－C18固相萃取小柱凈化。優(yōu)化了色譜、質(zhì)譜和前處理?xiàng)l件，有效提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度;方法具有良好的回收率和精密度，適用于豬肉中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的同時(shí)檢測(cè)。

［1］ Ministry of Agriculture of the People s Republic of China Bulletin No.560《Local Standards of Veterinary Drugs Abolished Directory》．(2005 －10 －28)．［2005 －11 －01］．http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t2005111 7_496523.htm．

［2］ Ministry of Health of the People s Republic of China．Food May Be Illegal and Non-food Substances Added to the List of Food Additives Have Been Abused(1－5 Batches Summary)．(2011－04－19).［2011－04－22］．http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/ht mLfiles/mohwsjdj/s9164/201104/51441.htm．

［3］ Deng J J，Wei W.Journal of Military Surgeon in Southwest China(鄧晶晶，衛(wèi)薇．西南軍醫(yī))，2009，11(5):925－926．

［4］ Sun X Q，Li Z，Lin W X．Chin.J.Food Hyg.(孫興權(quán)，李哲，林維宣．中國(guó)食品衛(wèi)生雜志)，2008，20(3):263－266．

［5］ Xiong L，Xin H W，Wu X C，Li Q，Yu A R，Shen Y，Su D．Military Med.J.South China(熊磊，辛華雯，吳笑春，李罄，余愛(ài)榮，沈楊，蘇丹．華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志)，2009，23(6):7，11－13，18．

［6］ Zhang H F，Song Q，Dai B，Zhang F C．Pharmaceutical Journal of Chinese People s Liberation Army(張華峰，宋青，戴博，張福成．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào))，2011，27(1):66－68．

［7］ Lin X L，Zhu J P，F(xiàn)ei Y．Chin.J.Clin.Pharm.(林秀麗，朱金平，費(fèi)燕．中國(guó)臨床藥學(xué)雜志)，2011，21(4):231－234．

［8］ Xu X M．China J.Mod.Med.(徐幸民．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志)，2004，14(14):105－106．

［9］ Lin W X，Sun X Q，Tian M，Yu L，Chen X，Li Z．J.Instrum.Anal.(林維宣，孫興權(quán)，田苗，于靈，陳溪，李哲．分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2009，28(2):212－215．

［10］ Liu J J，Jin F，She Y X，Liu H B，Shi X M，Wang M，Wang J，Xu S Y．Chin.J.Anal.Chem.(劉佳佳，金芬，佘永新，劉洪斌，史曉梅，王淼，王靜，徐思遠(yuǎn)．分析化學(xué))，2011，39(5):652－657．

［11］ Curren W S S，King J W．J.Chromatogr.A，2002，954(2):41－49．

［12］ Inoue K，Mizuno Y，Yoshimi Y．Liquid Chromatogr.，2008，31(9):3871－3878．

［13］ Lin W X，Sun X Q，Tian M，Yu L，Xiao S S，Li Z．China Dairy Ind.(林維宣，孫興權(quán)，田苗，于靈，肖珊珊，李哲．中國(guó)乳品工業(yè))，2009，37(3):46－48．

［14］ Su M，Ai L F，Duan W Z，Ha J．Chin.J.Anal.Lab.(蘇萌，艾連峰，段文仲，哈婧．分析試驗(yàn)室)，2012，31(3):73－77．

［15］ Yao M K，Ma B L，Ma Y M．Chin.J.Pharm.Anal.(姚夢(mèng)侃，馬秉亮，馬越鳴．藥物分析雜志)，2010，30(12):2436－2440．

［16］ Matuszewski B K，Constanzer M L，Chavez－Eng C M．Anal.Chem.，2003，75(13):3019－3030．

［17］ Hernando M D，Suarez－Barcena J M，Bueno M J，Garcia－Reyes J F，F(xiàn)ernandez－Alba A R．J.Chromatogr.A，2007，1155(1):62－73．

［18］ Dams R，Huestis M A，Lambert W E，Murphy C M．J.Am.Soc.Mass Spectrom．，2003，14(11):1290－1294．