馮小燕，張津，呂美玲，高明霞，張祥民*

(1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433;2.安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京 100102)

食品過(guò)敏原是指能夠選擇性地激活人體細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答，引起變態(tài)反應(yīng)的抗原性物質(zhì)。過(guò)敏原種類(lèi)繁多，且對(duì)人群的危害越來(lái)越嚴(yán)重［1］。一般地，引起食物過(guò)敏癥的過(guò)敏原多數(shù)來(lái)源于食物中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)中與過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的為其表面的抗原決定簇。常見(jiàn)的過(guò)敏食物是牛奶、雞蛋、魚(yú)、甲殼類(lèi)(蟹、蝦)、花生、大豆、堅(jiān)果類(lèi)(板栗、杏、腰果等)及小麥等，約占所有過(guò)敏食物的90%［2］。其中，牛乳及乳制品作為八大類(lèi)致敏食品之一，尤其影響嬰幼兒和兒童的身體健康?，F(xiàn)已知牛乳中有30種以上的蛋白質(zhì)同過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)，包括酪蛋白和乳清蛋白等主要成分［3］。目前，國(guó)內(nèi)的過(guò)敏原研究尚處在起步階段，研究對(duì)多種過(guò)敏原的同時(shí)檢測(cè)分析技術(shù)，已成為當(dāng)前食品過(guò)敏原研究的熱點(diǎn)之一［4，5］。

質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)因具有靈敏、準(zhǔn)確和特異等優(yōu)點(diǎn)，在基于蛋白組學(xué)的生物標(biāo)志物研究、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、定量蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)相互作用等研究領(lǐng)域日漸受到重視［6，7］。近年來(lái)，MRM 技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用得到進(jìn)一步拓展，使復(fù)雜目標(biāo)物的定性定量結(jié)果更為可靠［8，9］。

目前最常使用的檢測(cè)過(guò)敏原的分析方法是基于抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法和基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法。但是，ELISA 方法存在交叉作用且一次只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)物，效率較低;PCR 方法雖然可以實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物同步檢測(cè)，但是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，兩種方法都難以適用于當(dāng)今各種復(fù)雜食品的檢測(cè)［10，11］。本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)，選擇牛奶中主要過(guò)敏原α-酪蛋白(α-casein)為研究對(duì)象，建立檢測(cè)食物中牛奶過(guò)敏原的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260液相色譜-G6460三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，USA);質(zhì)譜5800 MALDI-TOF-TOFMS(Applied Biosystem，USA);島津Shimadzu 紫外分光光度計(jì)UV-1240(UV mini);超濾離心管Amicon Ultra-0.5，3000MWCO(Millipore，Billerica，USA);所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MA，USA)制得。

氨基丁三醇(trizma base，光譜純)、α-酪蛋白(光譜純)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA，光譜純)、二硫蘇糖醇(DTT，HPLC 級(jí))、碘乙酰胺(IAA，HPLC級(jí))、胰蛋白酶(trypsin，測(cè)序級(jí))(Sigma-Aldrich，USA);鹽酸、碳酸氫銨、甲酸(均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);乙腈(ACN)(HPLC 級(jí)，Dikma Technologies Inc，USA)。

脫脂奶粉、牛奶餅干、蛋黃派、小麥粉樣品為市售。

1.2 樣品提取

稱(chēng)取0.1 g 樣品粉末，加入1 mL pH 8.2的Tris-HCl 提取液于60℃充分振蕩1 h 后，置于4℃條件下以14000 r/min 離心10 min，取上清液再次離心10 min。將經(jīng)過(guò)兩次離心得到的上清液置于超濾離心管中超濾濃縮去除小分子雜質(zhì)得到蛋白質(zhì)提取液，并用Bradford 方法對(duì)提取到的總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。

1.3 蛋白質(zhì)酶解

使用胰蛋白酶對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。將一定濃度的蛋白質(zhì)溶液在沸水中煮5 min 變性，加入DTT(終濃度50 mmol/L)在60℃反應(yīng)30 min，再加入2倍(物質(zhì)的量)DTT的IAA，室溫下避光反應(yīng)1 h。加入NH4HCO3溶液使體系中蛋白質(zhì)的終濃度為1 g/L，NH4HCO3濃度達(dá)到25 mmol/L。加入胰蛋白酶(酶∶蛋白質(zhì)=1∶40，質(zhì)量比)于37℃酶解16 h。

酶解液直接進(jìn)行液相色譜、質(zhì)譜分析。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

反相色譜柱:Inertsil ODS-SP(250 mm ×4.6 mm，5μm)。流動(dòng)相:A 為10%乙腈水溶液(含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸)，B 為95%乙腈水溶液(含有0.09%(體積分?jǐn)?shù))甲酸)。流動(dòng)相梯度:5 min 內(nèi)從0線(xiàn)性上升到20%B，5 min 內(nèi)從20%B 線(xiàn)性上升到65%B，5 min 內(nèi)從65%B 線(xiàn)性上升到90%B并且保持3 min，然后3 min 內(nèi)線(xiàn)性回到100%A 并穩(wěn)定9 min，整個(gè)梯度在30 min 內(nèi)完成。流速:0.55 mL/min。進(jìn)樣體積:10μL。

1.4.2 MALDI-TOF-TOF-MS 條件

4700 ExplorerTM軟件控制，激光波長(zhǎng)337 nm，正離子反射模式，質(zhì)譜加速電壓20 kV，掃描范圍400～3000 Da。

1.4.3 三重四極桿質(zhì)譜條件

采用ESI 電離源;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流量:5 L/min;霧化氣壓力:310.275 kPa(45.0 psi);鞘氣溫度:250℃;鞘氣流量:11.0 L/min;毛細(xì)管電壓:4000 V(+)/3500 V(-);噴嘴電壓:500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 MRM 條件篩選優(yōu)化

目前普遍認(rèn)為α-酪蛋白和β-酪蛋白是牛奶的主要過(guò)敏原成分［12，13］。本研究的目的是檢測(cè)食物中是否含有牛奶主要過(guò)敏原成分，為此主要選擇含量較多的α-酪蛋白作為研究對(duì)象。α-酪蛋白的還原烷基化酶解液直接進(jìn)入5800MALDI-TOF 質(zhì)譜分析，得到一系列肽指紋圖譜(見(jiàn)圖1)。

圖1 α-酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的肽指紋圖譜Fig.1 MS spectrum of a tryptic digest of α-casein standard

按照選擇MRM 特征離子對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)，母離子應(yīng)符合以下條件:對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)有唯一性，帶電荷+2價(jià)到+4價(jià)，而子離子的相對(duì)分子質(zhì)量介于150～1400 Da 之間，具有一定強(qiáng)度和穩(wěn)定性。將αcasein 肽指紋信息利用Mascot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配驗(yàn)證，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［14，15］，確定了MRM 牛奶過(guò)敏原的特征離子對(duì)，并且利用G6460三重四極桿質(zhì)譜自帶的肽段優(yōu)化軟件對(duì)碎裂電壓(Fragmentor)和碰撞電壓(CE)等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化(見(jiàn)表1)。

表1 LC-MS/MS 檢測(cè)牛奶過(guò)敏原酶解肽段的MRM 參數(shù)Table 1 Parameters of the LC-MS/MS in MRM mode for profiling of tryptic peptides of the milk allergen protein

2.2 α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品考察方法的可靠性

為了減小不同樣品體系、不同進(jìn)樣批次中的離子化效率的差異，我們選擇了OVA 作為內(nèi)標(biāo)，每次進(jìn)樣加固定量的OVA 酶解液，以O(shè)VA的特征離子對(duì)673.3/222.9作為內(nèi)標(biāo)離子對(duì)，將各離子對(duì)的峰面積以?xún)?nèi)標(biāo)離子對(duì)為參照進(jìn)行統(tǒng)一校正。對(duì)于不同濃度的α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，得到各個(gè)特征離子對(duì)的MRM 提取離子流圖(見(jiàn)圖2)，對(duì)各提取離子流圖進(jìn)行積分和校正，得到相應(yīng)質(zhì)量濃度下的峰面積(見(jiàn)表2)。

圖2 α-酪蛋白各特征離子對(duì)的MRM 提取離子流圖Fig.2 Extracted MRM transitions for α-casein standard

表2 不同質(zhì)量濃度下α-酪蛋白的MRM 離子對(duì)峰面積Table 2 Peak areas of extracted MRM transitions for α-casein at different mass concentrations

在5對(duì)離子對(duì)中，598.3/158.1的離子流圖峰形對(duì)稱(chēng)性較好，其余離子對(duì)的峰形均有些不對(duì)稱(chēng)，原因可能是其他4個(gè)離子對(duì)保留時(shí)間都有重疊，離子化和碎裂過(guò)程彼此略有干擾。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線(xiàn)性曲線(xiàn)，結(jié)果表明5對(duì)離子對(duì)的檢出限為0.5 mg/L，在0.5～250 mg/L 范圍內(nèi)均有良好線(xiàn)性可以達(dá)到高靈敏檢測(cè)的要求。其中最強(qiáng)信號(hào)離子對(duì)為692.9/267.0:y=7.1348x -62.982，r2=0.995;最佳線(xiàn)性離子對(duì)為598.3/158.1:y=0.5406 x -0.8565，r2=0.9999(y 表示峰面積，103;x 表示蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/L)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，我們將小麥提取液的酶解液作為空白本體，添加不同質(zhì)量濃度(0.03、0.04、0.05 g/L)的α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶解液，進(jìn)行MRM 檢測(cè)，所得離子對(duì)峰面積利用之前標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系式進(jìn)行定量，回收率均在90%～106%之間，3次檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)于實(shí)際奶粉樣品進(jìn)行了提取蛋白質(zhì)、酶解以及MRM 檢測(cè)。雖然實(shí)際樣品中雜質(zhì)較多，質(zhì)譜檢測(cè)的母離子掃描有較多雜質(zhì)峰，但是MRM 方法在第二、第三兩步選擇離子的過(guò)程中除去了大量干擾離子，只保留目標(biāo)離子對(duì)，因此提取離子流圖與標(biāo)準(zhǔn)α-酪蛋白完全一致(見(jiàn)圖3)。

圖3 脫脂奶粉各特征離子對(duì)的MRM 提取離子流圖Fig.3 Extracted MRM transitions for α-casein from skim milk powder

用同樣方法對(duì)牛奶餅干、蛋黃派的夾心和外層均進(jìn)行了提取蛋白質(zhì)、酶解以及MRM 檢測(cè)，由于實(shí)際樣品中牛奶成分較少，導(dǎo)致部分離子對(duì)含量很低甚至無(wú)法檢測(cè)。所以選擇離子信號(hào)最強(qiáng)的離子對(duì)692.9/267.0作為定量離子對(duì)，得到以下提取離子流圖(見(jiàn)圖4)。

圖4 各實(shí)際樣品的MRM 提取離子流圖(692.9/267.0)Fig.4 Extracted MRM transition(692.9/267.0)for α-casein in real samples

由所得譜圖的峰面積，根據(jù)前面所得線(xiàn)性關(guān)系式計(jì)算實(shí)際含有α-酪蛋白的含量(見(jiàn)表3)。

表3 MRM 法檢測(cè)實(shí)際樣品中α-酪蛋白的含量Table 3 Contents of α-casein in real samples

由實(shí)際樣品結(jié)果可以看出奶粉中含有α-酪蛋白最多，而其余3種實(shí)際樣品均含有α-酪蛋白，表明該食品生產(chǎn)過(guò)程中添加了牛奶或者奶粉。如果在包裝上加以標(biāo)明，則可以避免牛奶過(guò)敏者誤食。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)建立質(zhì)譜MRM 方法，對(duì)牛奶蛋白質(zhì)中的主要過(guò)敏原α-酪蛋白酶解肽段進(jìn)行了分析。其最低檢出限為0.5 mg/L。α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在0.5～250 mg/L 范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。該方法對(duì)于牛奶樣品具有較好的特異性和靈敏度，并具有應(yīng)用于其他過(guò)敏食品或過(guò)敏蛋白質(zhì)的前景。該方法還可以推廣至其他過(guò)敏原蛋白的研究，發(fā)展可以應(yīng)用于多重食物過(guò)敏原的高靈敏檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)這一檢測(cè)方法的建立，有助于解決我國(guó)食品安全中的過(guò)敏問(wèn)題，并為制定我國(guó)食品過(guò)敏原標(biāo)簽管理奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

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