官詠儀，林海丹，鄒志飛，陳毓芳，金夢(mèng)，李小麗，秦燕

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州510623)

0 引 言

維生素B2(核黃素)是體內(nèi)多種氧化酶系統(tǒng)不可缺少的輔酶，是維持人體正常物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的低分子有機(jī)化合物。但其和其他的B族的維生素一樣，需以食物或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品來(lái)補(bǔ)充，嬰幼兒配方食品中添加量應(yīng)以維持能量代謝平衡為基礎(chǔ)，因此，測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯得尤為重要。

目前，維生素B2檢測(cè)方法常用的有高效液相色譜法、熒光分光光度計(jì)法[1,2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]等。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[4]為高效液相色譜法，其測(cè)定步驟繁瑣，測(cè)定的維生素B2包括游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的維生素B2，但嬰幼兒配方奶粉中的維生素B2主要以游離態(tài)形式存，因此本文對(duì)乳粉中維生素B2的快速測(cè)定進(jìn)行研究，篩選了沉淀蛋白和去除脂肪的方法，建立了簡(jiǎn)便、有效可行的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品(純度 99%,)；甲醇(色譜純)；偏磷酸、鹽酸(分析純)；超純水(由Mill-Q純水器系統(tǒng)制得)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀 (配有島津LC 20AD泵，SIL 20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，RF10AXL熒光檢測(cè)器，LC solution色譜工作站)；超聲波水浴；水平往復(fù)振蕩器；高速冷凍離心機(jī)；渦旋振蕩器。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

稱取25 mg(精確至0.1 mg)維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，加入鹽酸:水(1∶1，體積比)2 mL，超聲溶解后，用超純水定容至100 mL配成標(biāo)準(zhǔn)貯備液，質(zhì)量濃度為250 mg/L，置于4℃冰箱避光保存，保存期為3個(gè)月。臨用前用超純水將標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，3.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-H2O(33∶67,體積比)；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；激發(fā)波長(zhǎng)為462 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為522 nm。

1.5 樣品處理

稱取2 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入3%偏磷酸水溶液溶解并定容至50 mL，渦旋混勻1 min，置水平往復(fù)振蕩器上振蕩或超聲波水浴中超聲提取10 min(避光)，取出加入5 mL正己烷渦旋混勻1 min，轉(zhuǎn)速以不低于4 000 r/min離心5 min，下層水相經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾后，供液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相得選擇

實(shí)驗(yàn)常用的甲醇-水作為流動(dòng)相。結(jié)果表明，甲醇-H2O(33∶67,體積比)，在此色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)品峰形好，樣品在出峰時(shí)間無(wú)干擾峰。維生素B2標(biāo)準(zhǔn)和樣品的色譜結(jié)果如圖1和圖2所示。

2.2 提取溶液的選擇

維生素B2微溶于水，在強(qiáng)酸溶液中穩(wěn)定。奶粉為高蛋白的樣品，實(shí)驗(yàn)考慮采用酸性水相提取，還需兼顧去除蛋白、脂肪等雜質(zhì)干擾。對(duì)1%鹽酸、亞鐵氰化鉀和硫酸鋅溶液和3%偏磷酸作為沉淀劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明沉淀效果以3%偏磷酸最佳，1%鹽酸不能完全沉淀蛋白質(zhì)，亞鐵氰化鉀和硫酸鋅溶液為沉淀劑時(shí)回收率差。原因可能是維生素B2為6,7-

二甲基異咯嗪與核醇的縮合物，在N1和N10原子上具有兩個(gè)活潑的雙鍵，易發(fā)生氧化還原反應(yīng)[5]，因此不宜用亞鐵氰化鉀作沉淀劑。常見的偏磷酸有三偏磷酸和四偏磷酸，其水溶液pH值約為2，并含有、兩種離子，分別帶4和5個(gè)單位的負(fù)電荷。在酸性的偏磷酸水溶液中，蛋白質(zhì)所帶的正電荷被偏磷酸水溶液中的負(fù)電荷中和，同時(shí)偏磷酸溶液中的含氧酸根與水形成了穩(wěn)定的水合離子，奪取了蛋白質(zhì)膠粒表面上所持有的溶劑化水，破壞了膠粒的水化膜，膠粒完全失去了保護(hù)作用，隨即凝結(jié)沉淀[6]。蛋白質(zhì)中所含的不同蛋白有不同的等電點(diǎn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸不能達(dá)到全部蛋白的等電點(diǎn)，且鹽酸為一元強(qiáng)酸，所帶負(fù)電荷數(shù)量較偏磷酸少，與蛋白質(zhì)所帶正電荷的中和反應(yīng)速率較慢，因此未能快速完全的沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)。因此本實(shí)驗(yàn)最后采用3%偏磷酸作為提取溶劑。

2.3 凈化溶液的選擇

奶粉為高脂肪的樣品，因此提取溶液需要凈化脫脂，而分析物維生素B2極性強(qiáng)，不溶于非極性的有機(jī)溶劑，因此實(shí)驗(yàn)采用非極性溶劑正己烷去除脂肪達(dá)到凈化的效果，同時(shí)維生素B2的回收率理想。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍和定量限

維生素B2在0.05～3.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性良好，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.19×106x-1.73×104，線性相關(guān)系數(shù)為R大于0.99。方法的定量限為0.5 mg/kg。

2.4.2 方法的回收率與精密度

嬰幼兒配方奶粉中添加維生素B2的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5413.12-2010和本法對(duì)幾個(gè)不同品牌的嬰幼兒配方奶粉中的維生素B2進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，快速法與國(guó)標(biāo)法的結(jié)果無(wú)顯著性差異，相對(duì)誤差小于10%，試驗(yàn)表明嬰幼兒奶粉中的維生素B2存在形式游離態(tài)的添加的占絕大部分，只有小部分是結(jié)合態(tài)的天然本底值。

表2 快速法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

3 結(jié) 論

該方法測(cè)定乳粉中維生素B2，在添加5～50 mg/kg水平范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。方法的回收率和精密度符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中檢測(cè)方法確認(rèn)對(duì)回收率和精密度的技術(shù)要求。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、適合乳粉中維生素B2的檢測(cè)。

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[2]劉雯，王歡，朱參勝.等.熒光分光光度法測(cè)定尿中維生素B2[J].微量元素與健康研究.2010， 27(2)：38-40.

[3]王一紅，馮家力，潘振球.等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析10種水溶性維生素 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(7)：1160-1162.

[4]GB 5413.12-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測(cè)定[S].

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